Папилломатоз или вирусы папилломы человека
Human Papilloma virus (HPV) или вирусы папилломы человека (ВПЧ) относятся к роду Papillomavirus, к семейству Papovaviridae, вызывают развитие папиллом, в частности, генитальных. Вирусы содержат двунитевую кольцевую ДНК длиной около 8 тысяч пар оснований. Области генома L1 и L2 кодируют структурные белки вириона, а Е1-Е7 контролируют регуляторные функции, необходимые для размножения вируса и для проявления его трансформирующих свойств. Гены Е6 и Е7 являются основными, участвующими в трансформации нормальной клетки в опухолевую. Изолированная ДНК проявляет инфекционные и трансформирующие свойства.
Жизненный цикл папилломавирусов тесно связан с клеточной дифференцировкой: вирусная ДНК присутствует в клетках базального эпителия, а зрелые вирусные частицы обнаруживаются только в самых верхних слоях эпителия (в кератиноцитах на стадии терминальной дифференцировки). Вирусная ДНК в зараженных клетках может персистировать как в эписомальной, так и в интегрированной формах. Эписомальная форма (кольцевая двунитевая ДНК) может встраиваться в клеточный геном. Интеграция происходит случайным образом, т.е. специфичность локализации встраивания ДНК HPV в клеточную ДНК отсутствует. Интегрированная форма вирусной ДНК обнаруживается чаще на поздних стадиях злокачественной трансформации. Продукция вирусных частиц в опухолевых клетках в подавляющем большинстве случаев отсутствует.
Патогенез поражений, вызываемых папилломавирусами, прямо зависит от чувствительности клеток к вирусной инвазии. Продуктивная инфекция - результат заражения пермиссивных клеток (нормальная репликация вирусной ДНК и затем гибель клетки). Непродуктивная (абортивная) инфекция - результат заражения непермиссивных клеток. In vitro она приводит к трансформации клеток, напоминающей опухолевый рост. In vivo ДНК вируса в этом случае встраивается в геном клетки и продуцирует три опухолевых антигена.
Папилломавирусы обладают выраженным тропизмом к тканям кожных покровов и слизистых оболочек. Разные типы ВПЧ предпочтительно развиваются в соответствующих эпителиальных тканях. Все типы ВПЧ можно разделить на две большие группы, которые ассоциируются либо с кожей, либо со слизистыми оболочками.
Насчитывается более 100 типов ВПЧ. которые обозначаются номерами и делятся на группы по различной степени онкогенного риска (высокого, среднего и низкого). Большинство поражений, вызванных ВПЧ, доброкачественные (разнообразные бородавки), однако некоторые типы ВПЧ являются этиологическими агентами рака.
Эпидемиология, клинические проявления
Остановимся на папилломавирусной инфекции (ПВИ) гениталий. Генитальная ПВИ является одним из распространенных ЗППП (20-60% инфицированных лиц).
По ряду причин эта инфекция становится все более актуальной. Во-первых. ПВИ активно распространяется. Число инфицированных лиц в мире за последнее десятилетие увеличилось более чем в 10 раз. Во-вторых. ПВИ чрезвычайно сложна для диагностики, особенно ее латентная форма, при которой, несмотря на наличие вирусов, морфологических изменений в ткани не наблюдается. У более 15% женщин обнаружены ВПЧ в шейке матки при отсутствии клинической симптоматики. В-третьих, некоторые ВПЧ рассматриваются как этиологический фактор в развитии рака шейки матки. Рак шейки матки занимает второе место среди злокачественных новообразований у женщин.
Наиболее часто это заболевание выявляется среди молодых женщин (15-30 лет) (до 20% женщин), и связано, как правило, с ранним началом половой жизни и с большим количеством половых партнеров. Нередко в этом возрасте инфекция носит временный характер.
Среди женщин старше 35 лет лишь менее 10% являются носителями ВПЧ.
Возбудитель передается через микротравмы кожи. контактно, половым путем и перинатально. Инфицирование также может происходить бытовым путем через полотенца, одежду, хирургический инструментарий, в результате купания ребенка с инфицированной матерью. К инфицированию медперсонала ВПЧ может привести вдыхание вирусов, содержащихся в дыме, образующемся в результате лазерной деструкции генитальных бородавок. Установлен факт интранатальной передачи ВПЧ 16, 18 от матери ребенку. При этом у новорожденного была обнаружена ДНК вируса в области гениталий и/или полости рта.
Урогенитальные ВПЧ поражают слизистые всего урогенитального тракта, преимущественно плоский эпителий. ВПЧ нескольких типов могут вызывать развитие папиллом на слизистой оболочке ротовой полости и языке, чаще всего это происходит в результате орально-генитальных половых контактов.
Для развития ПВИ установлен ряд кофакторов - это курение, инфицированность вирусом простого герпеса и иммуносупрессия. При ослаблении иммунной системы ПВИ может особенно быстро прогрессировать. Носительство персистирующих ВПЧ без клинических проявлений - одна из причин распространения ПВИ. Частая смена половых партнеров является одним из основных факторов риска инфицирования ВПЧ.
Латентный период ПВИ с момента инфицирования и до появления клинических проявлений может длиться до 5-и лет (чаще от 1 до 2 месяцев).
Клинические проявления зависят от типовой принадлежности вируса и выраженности защитных реакций организма.
ПВИ подразделяют на клиническую, субклиническую и латентную формы.
Клиническая форма ПВИ является причиной соответствующих симптомов у пациентов и видима "невооруженным глазом". Проявлением клинической формы являются генитальные бородавки (остроконечные, плоские или эндофитные кондиломы).
Субклиническая форма не сопровождается симптомами, но может быть диагностирована при кольпоскопии или микроскопическом исследовании ткани. При субклинической форме ПВИ важно диагностировать различные морфологические изменения шейки матки. Морфологические изменения шейки матки, вызываемые ВПЧ, представляют собой спектр предраковых поражений, которые, в свою очередь, обозначаются как цервикальная интраэпителиальная неоплазия или дисплазия, способная прогрессировать в плоскоклеточную карциному. Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения могут спонтанно регрессировать, даже если были вызваны высокоонкогенными типами ВПЧ (16,18 и другими).
Латентная форма ПВИ не имеет клинических проявлений и не может быть диагностирована кольпоскопически, цитологически и гистологически. Присутствие ВПЧ в биоптатах шейки матки при латентной форме инфекции можно определить только по наличию ДНК вируса.
Онкогенность папилломавирусов вариабельна. По отечественным данным классификация типов ВПЧ: низкая степень онкогенного риска (6, 11, 42, 43, 44), средняя степень (31, 33, 35, 51, 52, 58) и высокая степень (16, 18, 45, 56).
По другим данным научно-медицинской литературы к доброкачественным ВПЧ (группа низкого онкогенного риска) относят типы 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66, и MM8 (P155). К ВПЧ высокого онкогенного риска относятся типы 16, 18 (распространены в нашем регионе), среднего -26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 (P291), MM9 (P238A). Наиболее часто встречаются остроконечные кондиломы гениталий, ассоциированные с ВПЧ типов 6 и 11. У женщин их обнаруживают на вульве, во влагалище и в цервикальном канале. У мужчин поражения чаще всего появляются на коже в перианальной области, на пенисе и в анальном канале. Возможна также бессимптомная инфекция.
Наиболее серьезным последствием инфекции ВПЧ высокого онкогенного риска является рак шейки матки. Опухоли шейки матки представляют собой вторую по частоте встречаемости раковую патологию у женщин со средней частотой 440 000 в год (по данным ВОЗ). ДНК ВПЧ высокого риска обнаруживается в 90% этого типа опухолей, и в настоящее время окончательно признано, что ВПЧ являются этиологическими агентами этого вида опухолей. Среди различных типов ВПЧ высокого риска тип 16 выявляется в 50-70% случаев неоплазий, тип 18 - в 10-20%. Остальные типы высокого и среднего риска выявляются при злокачественных новообразованиях значительно реже. Показана этиологическая роль инфекции, вызванной ВПЧ 16, 18, в развитии интраэпителиальной цервикальной неоплазии, а также плоскоклеточной карциномы шейки матки. ВПЧ обнаруживают при некоторых других видах рака (карцинома вульвы, рак пениса, анальной и перианальной областей, некоторые опухоли ротовой полости, карцинома среднего уха), однако со значительно более низкой частотой. ДНК ВПЧ 16, 18 была найдена в лимфатических узлах и гранулоцитах женщин с раком шейки матки, в яичниках и эндометрии, в опухолях мочевого пузыря, при раке протоков молочной железы, при папилломатозе гортани.
ВПЧ типов 16 и 18 в основном паразитируют в клетках эпителия шейки матки, а в уретральном канале мужчин находятся лишь непродолжительное время после инфицирования и, как правило, заболевания не вызывают. Поэтому ВПЧ 16, 18 редко выявляют у мужчин.
Злокачественному поражению шейки матки предшествует неопластическое изменение поверхностного эпителия. интраэпителиальная неоплазия. Для обозначения дисплазий различной степени тяжести был принят термин "цервикальная интраэпителиальная неоплазия" (CIN) и охарактеризованы морфологические стадии прогрессии рака шейки матки (CIN I, CINII, CIN III/ CIS). При этом дисплазия без лечения может наблюдаться в течение длительного времени и даже спонтанно регрессировать, хотя со степенью прогрессии и возрастом шансы на это уменьшаются и в сроки от 2 до 10 лет эти предраковые поражения могут привести к инвазивному раку шейки матки. Третья стадия интраэпителиальной неоплазии с вероятностью 35-50% может прогрессировать в инвазивный рак в течение 10 лет. Стадии 1 и 2 обладают меньшей прогрессирующей способностью и могут спонтанно регрессировать.
На стадии активной репродукции ВПЧ экспрессия генов Е6 и Е7 регулируется продуктом гена Е2, являющимся репрессором транскрипции этих генов. Именно поэтому, пока вирус находится в эписомальном состоянии, наблюдаются доброкачественные процессы разрастания инфицированных тканей. Ключевым событием в малигнизации клеток является интеграция вируса в геном клеток, которая сопровождается делецией гена Е2. Это событие имеет два важных последствия:
В эпителиальных клетках с интегрированной формой ВПЧ регистрируется сверхэкспрессия генов Е6 и Е7, так как в процессе интеграции утрачивается ген Е2, кодирующий репрессор транскрипции этих генов.
Любые противовирусные препараты бессильны остановить процесс опухолевой трансформации, так как инфицированные клетки не содержат вирус в традиционном понимании, и все лечебные мероприятия должны быть направлены на элиминацию клеток с интегрированной формой генома ВПЧ.
Дополнительными эпидемиологическими факторами риска развития генитальной неоплазии при папилломавирусной инфекции являются: изменение гормонального статуса, иммуносупрессия, другие инфекции (ВИЧ, бактериальный вагиноз и др.). Существует связь между обнаружением ВПЧ, выявлением Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealiticum/parvum, Candida albicans, Bacteroides sp. и избыточным ростом других анаэробов. Предполагается, что летучие амины, продуцируемые анаэробами при бактериальном вагинозе, могут играть роль коканцерогенных и митогенных факторов в развитии папилломавирус-индуцированных цервикальных неоплазий.
Иммунный ответ хозяина играет важную роль в предотвращении клинической манифестации ВПЧ-инфекции. ВПЧ вызывает как гуморальный, так и клеточный типы иммунного ответа. Клеточный иммунитет играет основную роль, как в персистенции, так и в спонтанном регрессе поражений, который может наступить через 6-8 мес.
Американская компания "Мерк" (Merck & Co. Inc.) 6 апреля 2005 г. объявила об успешном завершении II фазы клинических исследований экспериментальной вакцины "Гардасил" (Gardasil), предназначенной для предупреждения инфицирования вирусом папилломы человека (ВПЧ) и профилактики рака шейки матки. Как свидетельствуют результаты этого исследования, применение вакцины "Гардасил" по сравнению с плацебо приводит к достоверному снижению частоты инфицирования персистирующим ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов и связанных с этой инфекцией патологий, в том числе предраковых заболеваний шейки матки и остроконечных кондилом. Компания ГлаксоСмитКляйн разработала вакцину против ВПЧ 16, 18, которая содержит вирусоподобные частицы и адъювант ASO4 (Al+MPL*).
Тактика лечения ВПЧ-инфекции должна быть индивидуальной, с учетом: иммунного статуса, сопутствующей соматической патологии, сопутствующих урогенитальных инфекций, локализации патологического процесса, характера патологического процесса шейки матки, предшествующей противовирусной терапии. Лечение при наличии генитальных бородавок следует проводить обоим половым партнерам. В период лечения показан половой покой и барьерная контрацепция в течение 6 месяцев после окончания лечения. Эффективность лечения экзофитных кондилом составляет 50-94%, уровень рецидивирования - 25% в течение 3-х месяцев после лечения.
Основные методы лечения.
Применение цитотоксических препаратов - подофиллина, подофилотоксина, 5-фторурацила.
Деструктивные методы - физические (криодеструкция, лазеротерапия. диатермокоагуляция, электрохирургичекое иссечение), химические (трихлоруксусная кислота, ферезол, солкодерм).
Иммунологические методы -интерфероны.
Комбинированные методы - сочетание различных методов лечения.
Лекарственные препараты, используемые при локальном воздействии на ВПЧ.
Подофиллинотоксин (кондилин) в виде 0,5% раствора или геля,- это антимитотический растительный препарат из подофиллиновой смолы. В противоположность, подофиллину подофилокс имеет стабильную основу и не нуждается в смывании после аппликации; при нем менее вероятна системная интоксикация. Лечение заключается в нанесении препарата с помощью ватного аппликатора на очаг 2 раза в сутки в течение 3 дней. Через 4 дня проводят повторные циклы, количество которых составляет 4-5. Не рекомендуется наносить препарат на площадь более 10 см2 или использовать более 0,5 мл препарата в сутки.
Имиквимод - 5% крем, стимулирующий продукцию интерферона и других цитокинов, наносится на бородавку пальцем 3 раза в неделю (через ночь) в течение 16 недель. Зона лечения через 6-10 часов после аппликации крема обмывается мягким мылом и водой.
Подофиллинотоксин и имиквимод применяются больными самостоятельно, врач лишь в первый раз показывает и рассказывает о правилах применения. Однако подофиллин и имиквимод не применяются для терапии перианальных, ректальных, уретральных, вагинальных и цервикальных бородавок; безопасность использования имиквимода у беременных женщин не установлена.
Подофиллин - антимитотический растительный препарат, наносится врачом на бородавку ватным аппликатором в виде 10-25% спиртового раствора или настоя бензоина, однократно. Через 1-4 часа после нанесения смывается. Применяется 1-2 раза в неделю в течение 6 недель. Аппликации ограничиваются 0,5мл или 10см2 на сеанс лечения для снижения вероятности развития возможных системных эффектов, таких как подавление костного мозга. Не используется при беременности.
Трихлор - или бихлоруксусная кислота в виде 80-90% раствора может использоваться при лечении мелких мокнущих генитальных бородавок. Раствор наносится врачом на каждый элемент. Количество процедур до 6. В связи с низкой вязкостью обоих растворов существует риск местного раздражения, в связи с чем следует принять меры для защиты окружающей кожи, на которую для удаления кислоты наносится пищевая сода.
Ферезол в виде раствора наносится 1 раз в неделю, процедура продолжается 10 минут и более; повторно раствор наносится по мере подсыхания. Площадь обработки не должна превышать 29 см2. Количество процедур -2-5.
Аппликация солкодерма проводится стеклянным капилляром однократно. При недостаточной мумификации аппликация повторяется через 2-4 дня. Площадь обработки не должна превышать 4-5см2 или 4-5 элементов, при этом используется не более 0,2 мл препарата.
Эпиген спрей - основное действующее вещество глицирризиновая кислота, обладает противовирусным, противозудным, иммуномодулирующим, интерфероногенным действием. Лечение проводится путем орошения поверхности элементов 6 раз в день в течение 7 дней. При локализации бородавок во влагалище препарат можно применять с помощью вагинальной насадки 3 раза в сутки в течение 5 дней. Оставшиеся элементы удаляют методами физической или химической деструкции, после чего проводится повторный курс обработки эпителизирующихся участков эпигеном.
Криодеструкция основана на контролируемом врачом некрозе бородавки. Существуют 2 методики криотерапии: аппликационная (глубина криовоздействия не превышает 10 мм, используется для лечения поверхностных генитальных бородавок на коже и слизистых оболочках) и аэрозольная (с большей глубиной криовоздействия). Криовоздействие осуществляется жидким азотом или снегом угольной кислоты. Криодеструкция рекомендуется при ограниченном количестве мелких элементов (4-5), площадь обработки не должна превышать 5см2. Безопасность и эффективность метода во многом зависят от опыта врача.
Другие методы лечения, включающие внутриочаговое введение интерферона (иногда в сочетании с деструктивной терапией) и аппликации мази с 5% пять-фторурацилом (1 раз в сутки под марлевую салфетку в течение 7 дней или 1 раз в неделю в течение 10 недель) эффективны для лечения небольшого количества бородавок маленького диаметра.
I3C, выпускаемый в нашей стране под названием "Индинол" ("МираксФарма"), сегодня можно рассматривать как перспективный препарат в лечении ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки. Блокируя основные звенья вирусного канцерогенеза, он не только оказывает самостоятельное терапевтическое действие, но и повышает эффективность ИФН-терапии, делая опухолевые клетки более восприимчивыми к ней. ВПЧ- инфекция может сочетаться с герпетическими поражениями аногенитальной области. Лечение таких пациентов требует специальных подходов. Индинол действует с одинаковой эффективностью на вирусы герпеса, устойчивые к ацикловиру, и на ВПЧ. Индинол рекомендован МЗ РФ для лечения герпесвирусных инфекций, особенно в тех случаях, когда инфекция сочетается с ВПЧ или устойчива к терапии ацикловиром. Назначение индинола по 400 мг в день в течение 10-12 недель позволяет избежать рецидивов. Профилактический курс индинола - по 200 мг 2 раза в день в течение 12 недель.
При резистентных к проводимой терапии, распространенных гениальных бородавках могут использоваться: фотодинамическая терапия, комбинированная терапия с использованием электрокоагуляции (криодеструкции) и препаратов интерферона или ретиноидов (ацетритина и др.), а также комбинированное лечение с использованием электрокоагуляции, удаления оперативным лазером ("Скальпель- 2") или на аппарате радиоволновой терапии "Сургитрон" с последующими внутримышечными или внутриочаговыми инъекциями препаратов интерферона.
Лабораторная диагностика
Лабораторная диагностика, направленная на выявление ПВИ, имеет большое значение для постановки клинического диагноза, дифференциальной диагностики, лечения и профилактики заболеваний, вызванных ВПЧ. Раннее обнаружение ВПЧ высокого риска позволяет провести лечение до развития опухоли и дать прогноз развития заболевания. Особенно важно в этой связи развитие современных методов, направленных на типирование ВПЧ, диагностику латентной ПВИ и ранних предраковых поражений шейки матки.
Культуральный метод для детекции ВПЧ не применяется, т.к. чувствительная культура для размножения ВПЧ отсутствует.
Цитологический скрининг позволяет выявлять как предраковые образования, так и ранние стадии инвазивного рака. Для этой цели используется окрашивание мазков по Папаниколау (Pap-мазки). В нашей стране распространено окрашивание мазков по методу Романовского - Гимза. Об инфицированности ВПЧ свидетельствуют коилоциты (клетки с обширной зоной просветления вокруг ядра) и дискератоциты (клетки с увеличенным темным пикнотическим ядром из поверхностных ороговевающих слоев многослойного плоского эпителия).
Однако не следует забывать о следующих существенных недостатках цитологического исследования: 1) анализ позволяет диагностировать только клиническую и субклиническую формы инфекции; 2) существует возможность появления ложноотрицательных результатов при наличии плоскоклеточных интраэпителиальных поражений высокой степени тяжести (в мазок попадают чаще всего поверхностные клетки плоского эпителия, а койлоцитоатипия может наблюдаться в более глубоких слоях многослойного плоского эпителия); 3) чувствительность цитологических методов для обнаружения поражений шейки матки варьирует от 50 до 80%, что может быть отчасти компенсировано повторением теста через короткие промежутки времени; 4) отсутствие прогностических возможностей (методика дает информацию о состоянии рака шейки матки только на данный момент).
Кольпоскопия. При определении в цитологическом мазке дискариотических клеток необходимо кольпоскопическое исследование с целью подтверждения или исключения существования предракового поражения. Кольпоскопия рассматривается как наиболее чувствительный клинический метод определения субклинической формы ПВИ. При субклинической форме ПВИ шейки матки атипическая зона трансформации характеризуется такими кольпоскопическими картинами, как ацето-белые поражения, мозаика, пунктация или лейкоплакия. Субклиническая форма ПВИ может быть дифференцирована от интраэпителиальной неоплазии по следующим критериям: поражения могут иметь блестящий белый цвет, сморщенную поверхность, маленькие межкапиллярные расстояния, четкую границу между очагом поражения и прилежащими тканями, атипические сосуды. По некоторым данным кольпоскопию можно рассматривать не как диагностический метод, а как исследование, позволяющее оценить размеры поражения и его локализацию на границе плоского и цилиндрического эпителия, реже использовать диагностическую конизацию и исключить инвазивный рак. Кроме того, кольпоскопия используется для проведения диагностических биопсий в области стыка многослойного плоского и цилиндрического эпителия, т.е. в наиболее труднодоступных для обзора местах шейки матки. Проведение кольпоскопически ориентированной биопсии позволяет увеличить точность диагностики предраковых состояний шейки матки на 25%.
Гистологическое исследование. При гистологическом исследовании поражения шейки матки редко бывают однородными и могут наблюдаться все степени диспластических изменений. Субклиническая форма ПВИ сопровождается такими морфологическими особенностями, как акантоз, гиперплазия клеток базального и парабазального слоя многослойного плоского эпителия, пара- или гиперкератоз, клеточные элементы с койлоцитотической атипией. При возникновении морфологических признаков малигнизации установлено, что изменения, характерные для ПВИ, уменьшаются (например, койлоцитоз, продукция капсидного антигена), в то время как патология ДНК (анэуплоидия) и количество патологических митозов нарастает.
Определение антител к ВПЧ. Выявление того факта, что вирус папилломы быка (который можно сохранить в культуре ткани, в отличие от ВПЧ) имеет общие антигенные свойства с ВПЧ, привело к возможности создать тест-системы для подтверждения присутствия вирусных протеинов (АГ) в мазках и биоптатах шейки матки. Исследования, проведенные в последние годы, позволили определить антитела к некоторым ВПЧ. При клинической форме ПВИ были выявлены антитела к ВПЧ типа 11 в сыворотках пациентов с генитальными бородавками и папилломами гортани. Для ВПЧ типов 6, 11, 16, 18 и 33, поражающих половые органы, были идентифицированы серореактивные области внутри L1 и L2, Е4 и Е7 протеинов. Однако диагностических тест-систем для определения АТ к ВПЧ пока нет. Серологические методы для диагностики ПВИ мало перспективны, т.к. инфекция ВПЧ не всегда сопровождается продукцией вирусных АГ, способных вызвать образование АТ (АТ против ВПЧ обнаруживаются не у всех больных ПВИ), кроме того, обнаружение АТ не ко
ррелирует со стадией заболевания и не имеет, таким образом, диагностической значимости.
Метод ПЦР оказался особенно ценен для диагностики ПВИ, так как с его помощью можно не только установить наличие ДНК ВПЧ при любой форме ПВИ (в том числе при субклинической и латентной), но и идентифицировать тип ВПЧ и, следовательно, дать прогноз развития заболевания. Если в мазке обнаружены ВПЧ низкого риска (6, 11 и родственные), то можно ожидать развития доброкачественного процесса, если же выявляются ВПЧ высокого риска (типов 16, 18, 31, 33), то вероятность прогрессии злокачественной опухоли достаточно высока. Наиболее точный результат при выявлении ВПЧ высокого онкогенного риска можно получить, используя праймеры, локализованные в области генов Е6 и Е7. Это связано с тем, что именно этими генами определяется трансформирующая активность ВПЧ. Кроме того, при интеграции вирусной ДНК в клеточный геном некоторые участки вирусного генома в области L1 и Е1-Е2 могут быть повреждены или удалены. После интеграции вирусной ДНК продукции вирусных частиц не происходит. Поэтому обнару
жение только ДНК ВПЧ высокого риска (при отсутствии вирусных частиц) является однозначным указанием на инфицированность и принадлежность пациента к группе высокого риска.
ВПЧ 16,18 могут персистировать в латентной форме в клетках плоского эпителия шейки матки, не вызывая клинических проявлений, годами. Ранняя диагностика в таких случаях возможна только при профилактических обследованиях населения с использованием ПЦР.
Таким образом, ПЦР даёт возможность осуществлять раннюю диагностику с типированием ВПЧ, позволяющую предотвратить или не запустить рак шейки матки.
Система гибридной ловушки (или система двойной генной ловушки). Кроме ПЦР обнаружение ДНК ВПЧ возможно методом гибридной ловушки (Hybrid Capture). Метод был разработан фирмой "Digene" (США), поэтому его иногда называют "Digene-тест". Он заключается в гибридизации ДНК ВПЧ (всей длины) с РНК-зондом в растворе с последующей сорбцией гибрида на полистероловой планшете, захватом гибрида моноклональными антителами, меченными ферментом, и, наконец, измерением хемилюминесценции. Это высокоспецифичный количественный метод (интенсивность испускаемого света пропорцианально количеству ДНК вирусов). Чувствительность метода 5000 копий ДНК ВПЧ в мл. Типирование возможно только двух групп ВПЧ: высокого онкогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) и низкого онкогенного риска (6, 11, 42, 43, 44). Высокий уровень содержания ВПЧ связан с тяжестью заболевания, повышает риск развития опухоли, поэтому количественный показатель данного теста обладает диагностической ценност
ью.
Однако в случае выявления онкогенных ВПЧ в независимости от их количества необходимо применять лечебно-профилактические мероприятия.
Современные подходы к диагностике папилломавирусной инфекции гениталий основаны на комбинации классических методов (цитологического и кольпоскопического исследований) и современного тестирования методом ПЦР или методом гибридной ловушки. Это позволяет существенно увеличить эффективность первичного и вторичного скрининга рака шейки матки. Многие авторы рекомендуют комбинировать данные методы в зависимости от клинической ситуации.
Существует концепция первичного скрининга:
использование только цитологической диагностики для женщин моложе 30 лет,
цитологическое исследование шеечных мазков и ВПЧ-тестирование методом ПЦР - для женщин старше 30 лет.
Такая политика определяется тем фактом, что у женщин моложе 30 лет более 70% поражений, вызванных ВПЧ, регрессируют спонтанно, тогда как у женщин среднего возраста, в связи с персистенцией вируса, поражения регрессируют значительно реже.
В случае обнаружения ДНК папилломавирусов высокого онкогенного риска, пациентке следует обратиться к врачу гинекологу-онкологу, посещать его 1 раз в 3 месяца.
ПЦР-тест-системы
Последовательности ДНК папилломавирусов чрезвычайно разнообразны. Имеются сильные различия между типами и даже внутри типа. Поэтому нами были разработаны консенсусные праймеры. В качестве мишени для этих праймеров был выбран фрагмент гена одного из онкогенов вируса. Эти гены обнаруживаются в геноме трансформированных клеток человека и могут вызывать раковое перерождение тканей. Поэтому с помощью данной тест-системы можно определить как наличие папилломавирусов типов 16,18, 31, 33, так и их онкогенность, т.е. возможность развития онкологического заболевания.
Разработана тест-система для выявления ДНК ВПЧ всех типов, без типирования - Human Papillomavirus sp. В ряде случаев, возникает необходимость определения вирусной природы лейкоплакий. Тогда, если был получен отрицательный результат по типам 16, 18, 31 33, - необходимо выяснить, нет ли в ткани каких-либо других ВПЧ. Это важно для постановки дифференциального этиологического диагноза и выбора пути лечения. Если папилломавирусная инфекция требует деструктивных методов лечения с последующей иммунокоррекцией, то плоскоклеточная гиперплазия вульвы требует применения кортикостероидных препаратов.
Наши ПЦР-тест-системы для выявления ВПЧ позволяют обнаруживать в исследуемом биоматериале не менее 1000 молекул ДНК ВПЧ в мл (что соответствует - не менее 10 молекул ДНК в 5мкл обработанной пробы, вносимых в амплификационную смесь). Специфичность тест-систем - 95%.
Требования к пробе биоматериала для выявления ВПЧ в ПЦР-исследовании очень определенные - клинический материал должен содержать клетки эпителия, взятые с предполагаемого места поражения.