Диагностика инфекции H.pylori у детей

Щербаков П.Л. Научный Центр Здоровья Детей РАМН, Москва

На протяжении 16 летней истории изучения проблемы H.pylori инфекции одной из главной проблем является ее своевременное и достоверное распознавание. Все способы диагностики, используемые в настоящее время, условно можно разделить на прямые и непрямые, на инвазивные и неинвазивные.

Прямые методы основаны на обнаружении микроорганизмов с помощью гистологических, микробиологических или молекулярных способов. Непрямые методы регистрируют продукты жизнедеятельности микробов или различные активные соединения, образуемые макроорганизмом в ответ на инвазию H.pylori (антигены H.pylori, специфические АТ и пр.). Все используемые методики выявления хеликобактериоза имеют различную специфичность и чувствительность.

Большинство прямых методов в настоящее время основаны на инвазивных способах забора материала. Прямая диагностика инфекции H.pylori в настоящее время является достаточно трудоемким и отсроченным по времени процессом. Она включает себя проведение эзофагогастродуоденоскопии с взятием биоптатов слизистой оболочки для последующего исследования.

Эндоскопическое исследование органов пищеварения нельзя рассматривать только в качестве посреднического исследования для получения биоптатов слизистой. Эзофагогастродуоденоскопия имеет значительную самостоятельную диагностическую ценность. Во время ее проведения определяются достаточно специфические эндоскопические признаки, характерные для хеликобактерной инфекции. В частности к ним относятся: наличие язв в луковице двенадцатиперстной кишки, множественные разнокалиберные выбухания на стенках слизистой оболочки антрального отдела желудка, гиперемия слизистой оболочки, наличие мутной слизи в просвете желудка, отек и утолщение складок антрального отдела и тела желудка [12]

Чувствительность и специфичность отдельных признаков различна. Наиболее достоверными являются язвы луковицы двенадцатиперстной кишки (чувствительность и специфичность 100%) и наличие разнокалиберных выбуханий на стенках антрального отдела желудка (чувствительность 93%, специфичность 96%). Аналогичные данные позже были получены и другими исследователями, которые подчеркивают ведущее диагностическое значение выбуханий в антральном отделе, бывающими столь выраженными, что получили название “нодулярного гастрита”. При этом слизистая оболочка желудка приобретает характерную картину “булыжной мостовой” [14, 15].

Биоптаты слизистой оболочки желудка для проведения дальнейших исследований забираются из антрального отдела и тела желудка под контролем зрения. Обычно фрагменты слизистой оболочки берутся из антрального отдела по вершинам воображаемого равностороннего треугольника с привратником в центре, на расстоянии 2-4 см от него; из тела желудка по большой и малой кривизне и из свода желудка.

Морфологическое исследование биоптата слизистой оболочки с оценкой степени обсемененности позволяют достаточно достоверно определять H.pylori и являются своеобразным “золотым стандартом” при сравнении информативности различных способов диагностики хеликобактериоза [10]. Для выявления H.pylori на поверхности слизистой оболочки используют различные методики окраски срезов биоптатов. Наиболее часто используются окраски акридиновым оранжевым (чувствительность составляет 85%), методом Гимзы (79%), серебрением по Вартин-Старри (67%) [16]. Наиболее чувствительным, для обнаружения H.pylori, является иммуноцитохимический метод с моноклональными антителами и комплексом авидин биотин пероксидазы. Моноклональные АТ избирательно окрашивают только H.pylori, что значительно облегчает диагностику [11]. При изучении биоптатов выделяют три степени обсемененности СО H.pylori: 1.слабая - до 20 микробных тел в поле зрения (х630), 2.средняя - до 50 микробных тел в поле зрения, 3.- сильная - более 50 микробных тел в поле зрения, обозначаемые условными знаками (+-; ++; +++) [1]

Наибольшую информацию о H.pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. При использовании бактериологического метода возможно не только получение чистой культуры возбудителя, но и ее идентификация с дальнейшим изучением биологических свойств. Бактериологическое исследование незаменимо и при контроле лечения, когда количество бактерий в организме может быть настолько малым, что не определяется другими методами лабораторной диагностики [7].

В эпидемиологической практике выделение чистой культуры необходимо для внутривидового типирования штаммов H.pylori, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, обусловленным тем же штаммом. В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности H.pylori и изготовлять препараты для серологической диагностики. К недостаткам этого метода относятся, прежде всего, необходимость специального оборудования лаборатории и реактивов позволяющих выделять и идентифицировать H.pylori, а также обученных кадров специалистов. Все это сопряжено с большими материальными затратами [7].

Результаты исследования отсрочены от момента взятия биопсии минимум на 3-5 дней, рост чистой культуры на питательной среде обнаруживается, как правило, только при обострении заболевания и наличии выраженных визуальных признаков воспаления. Поскольку H.pylori очень чувствителен к условиям внешней среды и быстро погибает, необходимо строго соблюдать правила транспортировки биопсийного материала. Лучшей, на сегодняшний день средой, для транспортировки биопсийных образцов признана Pylori® (Bio-Merioux, Франция), которая способна стабильно поддерживать жизнеспособность чистой культуры H.pylori в течении 4-5 суток. Посев биопсийного материала производят не менее чем на 2 питательные среды (неселективную и селективную). Для культивирования и выделения H.pylori предложено достаточно большое количество неселективных питательных сред с 5-10% содержанием крови лошади или барана и агаром. Поскольку природная экологическая ниша H.pylori не является стерильной, то для выделения H.pylori из биоптатов лучше всего использовать селективные питательные среды, содержащие антибактериальные препараты, в состав которых включены ингибиторы роста кокковой, кишечной и грибковой микрофлоры. При культивировании H.pylori возникают определенные трудности, так как эти микроорганизмы микроаэрофилы и растут в особых условиях. Необходимую для культивирования атмосферу создают заполнением анаэростатов газовой смесью или с помощью коммерческих газогенерирующих пакетов. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0 при 32-39° С. Как правило на неселективной питательной среде H.pylori на 3-5 сутки формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии H.pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолиумхлорида [13].

При получении роста колоний, по морфологии сходных с H.pylori, проводится их идентификация, которая включает в себя окраску мазка по и 3 биохимических теста - уреазный, каталазный и пероксидазный (все 3 теста положительные) [7].

Наиболее достоверным в диагностике H.pylori инфекции является использование полимеразной цепной реакции для идентификации этого микроорганизма. В настоящее время полностью расшифрована генная структура H.pylori. Проведение ПЦР позволяет обнаруживать в биоптатах СО генетический материал, специфичный для рода Нelicobacter (16S-рРНК) и вида Н.рylori (гены ureA, ureB, cagA, vacA и другие).

ПЦР, изобретенная Kary Mullis и улучшенная впоследствии другими исследователями, фундаментально изменила молекулярную биологию, открыв новые горизонты в медицинских и биологических науках. По своей мощности это новое биологическое исследование может быть сравнимо с открытием методов молекулярного клонирования приблизительно 25 лет назад. В основу ПЦР положена удивительно простая концепция, впервые предложенная 30 лет назад и очень напоминающая способ, посредством которого клетки дублируют свою ДНК in vivo. Цикл реакции составлен из трех этапов: денатурации (для полного разделения двух цепочек в ДНК молекулах); ренатурации (формирование комплекса между праймерами и целевой последовательностью); этап расширения (соединение праймера с цепочкой ДНК, удлиняясь с помощью полимераз). После денатурации две цепочки ДНК отделяются, и каждый праймер высвобождается для поиска комплементарной последовательности. В процессе охлаждения отжиг праймера к исследуемой области формирует устойчивый комплекс, который далее стабилизируется собственно полимеразой. В конце цикла в пробирке имеется вдвое большее количество ДНК по сравнению с первоначальным количеством. Затем цикл повторяется, и количество ДНК удваивается далее с каждым циклом. Эта амплификация совершается в геометрической прогрессии совершенно аналогично ядерной цепной реакции с двукратным, четырехкратным, восьмикратным, 16-кратным, 32-кратным, и т. д. увеличением при последующих циклах. После n циклов степень амплификации - соответственно 2n. Таким образом, после 10 циклов достигается 1024-кратная амплификация, а после 20 - 106-кратная [8].

В последнее время появилась возможность проводить ПЦР-диагностику по определенным участкам гена (в частности ureC) на основе высокоспецифичных для данного микроорганизма праймерами. Этот метод диагностики позволяет диагностироваить наличие H.pylori как в вегетативной, так и в кокковой форме. Более того, в последнее время появились отечественные разработки проведения ПЦР из образцов кала. Это позволит сделать метод ДНК-диагностики H.pylori неинвазивным, что существенно расширит спектр его применения в клинике [3].

Гистологические и микробиологические исследования, обладают высокой информативностью и достоверностью, но являются трудоемкими и достаточно длительными.

В связи с этим приобретает особую актуальность разработка новых диагностических экспресс-тестов и стандартизация признаков хеликобактериоза, выявляемых при различных исследованиях органов пищеварения.

Нами проводилась оценка эффективности нескольких видов экспресс-тестов для диагностики ПХ: промышленные наборы “CLO-test” фирмы “Delta” (Австралия), “Де-нол -тест” фирмы “Yamanouchi”(Япония) и лабораторные тесты “Campy-test”, разработанный под руководством проф. П.Я.Григорьева (1989), “Хеликотест”, предложенный к.б.н. В.Г.Жуховицким (1992) и быстрый уреазный тест, разработанный в ЦКБ МЦ УД Президента РФ.

Экспресс-диагностика пилорического хеликобактериоза основана на свойстве H.pylori - в огромном количестве (по сравнению с другими микробами) выделять уреазу, которая разлагает мочевину, входящую в состав диагностического теста, на углекислый газ и аммиак. В результате этого рН среды смещается в щелочную сторону и регистрируется по изменению окраски диагностикума. Время экспозиции после помещения биоптата в среду различно. Так, при выполнении CLO - теста и Campy-теста результат получали через 24 часа, проведение Хеликотеста позволяло сделать заключение о наличии Н.pylori в течение 2 часов. Самыми “быстрыми” тестами явились Де-нол тест и быстрый урезный тест, при которых результат оценивался в течение 5-20 мин.

Все экспресс-методы обладали разной чувствительностью и специфичностью (Таблица 1)

ТАБЛИЦА 1.

Сравнительная характеристика экспресс-тестов для диагностики H.pylori.