Апоптоз в яичниках

С. О. Дубровина

Представлены современные данные о роли апоптоза в функционировании яичников не только в норме, но при развитии опухолевого процесса. На программированную гибель клеток в яичниках влияют не только гены-регуляторы апоптоза, но и различные цитокины и гормоны. Нарушения апоптоза вовлечены также в патогенез хронической ановуляции, овариальной дисфункции. Представленный обзор освещает также влияние апоптоза на исходы программ ЭКО.

Термин "апоптоз" введен в 1972 г. J.F. Kerr для обозначения формы гибели клеток, прототипом которой является гибель тимоцитов под действием глюкокортикоидов. Это форма клеточной смерти была отождествлена с ранее описанной программированной гибелью клеток, т.е. активной формой гибели клетки, являющейся результатом ее генетической программы или ответом на внешние силы и требующей затрат энергии. Слово "апоптоз" по-гречески означает "опадание листьев с деревьев". Этот термин используют для обозначения тех форм гибели клеток, которые являются результатом активных запрограммированных внутриклеточных процессов и сопровождаются сморщиванием клеток, уменьшением их объема [62]. Описано не менее 6 форм клеточной гибели: апоптоз, автохизис, анойкиз, параптоз, автофагоцитоз, некроз.

Принято считать, что основное предназначение апоптоза как физиологического процесса - поддержание постоянного количества клеточных элементов в органах и тканях организма и удаление клеток, прошедших свой жизненный цикл. Апоптоз является обязательным компонентом жизни многоклеточных организмов, одновременно он вносит свой вклад в реакцию организма на внешние воздействия. Морфологические признаки апоптоза: уменьшение размеров, сморщивание ядра клетки, уплотнение и фрагментация хроматина. В ядре формируются осмофильные скопления хроматина, обычно прилежащие к ядерной оболочке. Эти изменения являются самым ранним проявлением апоптоза, предшествующим процессам деградации. В этой стадии прогрессирование апоптоза может быть остановлено действием ингибиторов. Затем в ядерной мембране образуются инвагинации, хроматиновые фрагменты отшнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называются апоптотическими тельцами.

В отличие от некроза, при котором одновременно гибнут массы соседствующих клеток, апоптоз развивается изолированно в единичных клетках. Если в случае некроза из клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в частности лизосомы, что нередко приводит к развитию или прогрессированию воспаления, то при апоптозе подобные явления отсутствуют. Клетки, подвергшиеся апоптозу, и апоптотические тельца быстро фагоцитируются не только макрофагами, но и "непрофессиональными" фагоцитами [49]. Видимо, в этом и состоит смысл апоптоза - утилизация еще живых апоптозных телец, не вызывающая воспалительных явлений, пока содержимое клетки не попадает во внеклеточную среду, т.е. уничтожение клеток путем апоптоза обеспечивает минимальное повреждение тканей по сравнению с другими механизмами смерти.

Одно из проявлений фагоцитоза на биохимическом уровне состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 250, 50 тыс. пар оснований. Уже в этой стадии регистрируются конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны. Именно этот этап выпячивания хроматина считается ключевым событием апоптоза, после которого процесс становится необратимым. Фрагментации ДНК (межнуклеосомная деградация) определяется в виде лесенки при электрофорезе (используемый метод лабораторной диагностики апоптоза). При некрозе распад ДНК имеет размазанный характер при том же методе исследования.

Начиная с 2000 г. апоптозу в яичниках посвящено огромное количество работ [8, 14, 16, 35, 42, 50, 52, 54, 59, 60, 64].

Было доказано на культуре клеток яичника, что апоптоз - основной механизм атрезии фолликулов [9]. В яичниках апоптоз происходит в атретических фолликулах, в эпителии яичника в момент овуляции, в желтом теле [41].

Еще в 1993 г. F.M. Hurwitz и E.Y. Adashi описали морфологическое сходство между фолликулярной атрезией и апоптозом. Во время процесса овуляции клетки эпителия яичника, покрывающие поверхность преовуляторного фолликула, подвергаются дегенерации, морфологически сходной с апоптозом. Простагландины индуцируют ДНК-фрагментацию в эпителиальных поверхностных клетках яичника, вовлекая эпителий яичников в апоптоз в период овуляции. Апоптоз предотвращается блокированием овуляции индометацином, ингибитором простагландинов.

Гранулезные клетки - основной тип клеток, подвергающихся апоптозу в яичнике в исследованиях in vivo и in vitro [7]. Уровень апоптоза значительно выше в гранулезных клетках яичников без доминантного фолликула в сравнении с гранулезными клетками яичника с доминантным фолликулом [30]. Апоптоз происходит в гранулезных клетках фолликулов любого размера, но соотношение апоптотических клеток зависит от размера фолликула и дня менструального цикла. Выраженность апоптоза максимальна в больших фолликулах на 9-й и 18-й дни цикла, в то время как в средних фолликулах в эти дни она минимальна. В маленьких фолликулах нет существенной разницы в уровне апоптоза в различные дни менструального цикла [67].

Атрезия может начаться в любой стадии развития фолликулов. Атрезия третичных фолликулов - важнейший процесс в редукции тысяч фолликулов, которые никогда не будут овулировать. Фолликулярная атрезия начинается сразу после рождения и продолжается много лет. Обязательным условием для развития вторичного фолликула из первичного является экспрессия во вторичном фолликуле bcl-2, защищающем от апоптоза [10].

Прогестерон подавляет апоптоз гранулезных клеток в ранних фолликулах [43]. Апоптоз гранулезных клеток связан с дисбалансом между прогестероном и эстрадиолом в фолликулярной жидкости [66]. Уровень прогестерона и эстрадиола в фолликулярной жидкости меняется независимо от концентрации в сыворотке в течение менструального цикла, но зависит от размера фолликула и степени атрезии [39]. Концентрация эстрадиола и прогестерона и уровень апоптоза в доминантных фолликулах меняются прямо противоположно в сравнении со средними фолликулами, подтверждая мнение о том, что доминантные фолликулы подавляют рост субдоминантных [67].

K. Kugu и соавт. [18] идентифицировали в яичниках белки bcl, bax и р53. Семейство белков bcl-2 включает некоторые важнейшие регуляторы апоптоза. Среди них bcl-2 и bcl-xl предотвращают апоптоз, в то время как bax и bcl-xS индуцируют клеточную смерть. Иммуногистохимически доказано, что b сl-2 экспрессируется в середине лютеиновой фазы в лютеиновых клетках, но не в регрессирующем желтом теле. Наиболее высокие уровни bax, наоборот, определяются в регрессирующем желтом теле [38]. Альтерация регулирования этого процесса может привести к снижению клеточной смерти и развитию неопроцесса. Содержание bcl-2 выше в нормальных тканях, в то же время высокий уровень bax и bcl-xS отмечается в карциноме. Доказано, что в развитии рака яичника играет роль семейство генов-регуляторов апоптоза bcl-2, но не р53 [26]. Накопление же белка р53 в клетках приводит не к гибели раковых клеток, а к анти-р53-антителопродукции и к появлению соответствующих антител в сыворотке крови [47].

Важным регулятором развития фолликула и желтого тела является р53 [56, 68]. Апоптоз клеток гранулезы связан с экспрессией р53 [55], который запускает процесс апоптоза только в гранулезных клетках зрелого преовуляторного фолликула [1]. Однако согласно другим исследованиям, экспрессия р53 увеличивается одновременно с ростом количества апоптотических клеток гранулезы и тека-клеток, а также изменяется при созревании фолликула и находится в обратной зависимости от уровня ХГ, так как ХГ блокирует апоптоз и подавляет индукцию р53 [24]. Сопутствующая аккумуляции органелл стероидогенеза в перинуклеарном пространстве способность протеосом к дегенерации совпадает с аккумуляцией р53 в ядре [1].

Кроме того, апоптоз гранулезных клеток яичника контролируют ген Fas и его лиганд FasL, где Fas выступает в роли рецептора, а FasL стимулирует апоптоз при связывании с Fas [27]. В первичных и примордиальных фолликулах только овоциты иммунопозитивны к Fas. Во вторичных и антральных фолликулах овоциты слабо иммунопозитивны. В преовуляторных фолликулах ни гранулезные клетки, ни тека-клетки, ни овоциты не дают положительную реакцию на Fas. В желтом теле отмечается повышение иммунопозитивного ответа во время поздней лютеиновой фазы. Белое тело не дает окрашивания на Fas. Следовательно, именно Fas-антиген является медиатором апоптоза при регрессии желтого тела и фолликулярной атрезии [17]. Fas-зависимый апоптоз может быть приведен в действие FasL овоцитов в преантральных фолликулах, а также овоцитов или соматических клеток в антральных фолликулах. У мышей с потерей Fas накапливаются фолликулы средних размеров или развиваются кисты яичников. Это подчеркивает роль системы Fas в апоптозе фолликулярных клеток [48, 63]. Fas играет несомненную роль в лютеолизе [19]. Fas идентифицирован в клетках гранулезы и теки, его экспрессия увеличивается после обработки культуры этих клеток интерфероном, но не фактором некроза опухолей (TNF). Клетки гранулезы и теки устойчивы к FasL-зависимому апоптозу после обработки интерфероном. TNF не дает подобный эффект [57]. Оксид азота подавляет FasL-зависимый апоптоз, вызывающий фолликулярную атрезию [3]. Прогестерон ингибирует апоптоз в клетках желтого тела путем подавления Fas и активности 3-каспазы [38]. Концентрация sFas в сыворотке крови значительно ниже в группе больных с СПКЯ по сравнению с этим показателем у женщин с мужским фактором бесплодия в браке. Метформин увеличивает уровень sFas в крови и понижает концентрацию sFasL в фолликулярной жидкости (в сравнении с действием плацебо) [40].

Концентрация sFas в сыворотке крови у больных с доброкачественными кистами яичников и у здоровых женщин составляет соответственно в среднем 2,3 нг/мл (в пределах 1,3-4,1) и 1,5 нг/мл (0,1-5,6),

p<0,01 [13]. Отмечается повышенный уровень ФСГ, ЛГ в сыворотке крови и особенно в содержимом кист при неопластических процессах по сравнению с таковым в функциональных кистах. Кроме того, в аспирате содержимого функциональных кист, напротив, повышено содержание эстрадиола. Таким образом, концентрации гонадотропинов и эстрадиола в содержимом неопластических и функциональных кист прямо противоположны [5].

Базовым моментом фрагментации ДНК в поверхностных эпителиальных клетках яичника в норме при овуляции является воздействие прогестерона [34]. Фрагментация ДНК, апоптоз происходят в эпителиальных клетках в месте овуляции. Клетки, содержащие фрагментированную ДНК, экспрессируют р53 [36]. Тем не менее роль апоптоза в таких патологических процессах, как хроническая ановуляция, овариальная дисфункция, до сих пор до конца неясна [58]. Неизвестен также механизм, нарушающий нормальный процесс апоптоза в яичниках. Но, возможно, он может быть вызван белками, ингибирующими апоптоз (IАР), семейством ингибиторов каспаз, два из которых локализованы в яичниках крыс. Кроме того, белок, ингибирующий апоптоз нейронов (NAIP), может предотвращать апоптоз антральных фолликулов [11, 23, 28].

Факторы роста, локально продуцируемые цитокины, являются паракринными и аутокринными яичниковыми регуляторами. Некоторые факторы роста и гормоны, включая эстрогены, подавляют апоптоз в яичниках [51]. Фактор роста гепатоцитов (ICR), наоборот, разрушает межклеточные контакты, повышая уровень внутриклеточного Са2+ и стимулируя рецепторы 3-го типа к трифосфату, тем самым индуцирует апоптоз эпителиальных клеток яичника [20]. TGF-b1 индуцирует и поддерживает апоптоз клеток яичника [4, 25, 33, 46].

Инсулиноподобный фактор роста (IGF) подавляет апоптоз клеток яичника [21].

Большинство гранулезных клеток здоровых антральных и преантральных фолликулов PCNA*-положительны. Факторы IGF-I, IGF-IR, TGF-b,

TGF-b R, Fas и FasL могут определяться иммуногистохимическим методом в гранулезных клетках здоровых антральных фолликулов. Но в атретических антральных фолликулах гранулезные клетки иммунопозитивны только к TGF-b, TGF-b R и Fas. IGF-I может играть важную роль в стимуляции пролиферации гранулезных клеток. TGF-b, FasL и Fas - важные медиаторы апоптоза в гранулезных клетках антральных фолликулов. Но их эффект как медиаторов может быть подавлен IGF [22]. Концентрация в фолликулярной жидкости IGF-I (но не IGF-II) является решающим фактором в определении, какой из фолликулов станет зрелым, а какой подвергнется атрезии [66].

Оральные контрацептивы индуцируют апоптоз в эпителии яичника. При этом максимальный эффект дает левоноргестрел [45]. Андрогены усиливают фрагментацию ДНК в гранулезных клетках, снижают экспрессию bсl-2, в то время как эстрогены дают противоположный эффект [61]. Компонент оральных контрацептивов (ОК) прогестин индуцирует апоптоз в яичниковом эпителии [46]. Прогестерон повышает активность р53. Высокие концентрации эстрадиола подавляют апоптоз [37]. Экспрессия FasL в клетках желтого тела регулируется пролактином [19].

Известно, что основной фактор роста фибробласта (оФРФ) подавляет апоптоз так же эффективно, как гонадотропины в преовуляторных фолликулах. В ранних антральных фолликулах оФРФ дает минимальный эффект подавления апоптоза. Содержание рецепторов в преовуляторном фолликуле значительно выше, чем в раннем антральном фолликуле, что объясняет высокую потенциальную возможность влияния на апоптоз в преовуляторном фолликуле по сравнению с ранним антральным. При этом оФРФ не влияет на супрессию апоптоза в преантральных фолликулах [29]. ИЛ-6 стимулирует апоптоз гранулезных клеток. Среди всех цитокинов ИЛ-1 играет важнейшую роль регулятора дифференцировки фолликулов. В культуре преовуляторных фолликулов ИЛ-1b подавляет апоптоз, добавление антагониста рецептора ИЛ-1 в культуру клеток подавляет этот эффект [6]. Кроме того, супрессивное действие гонадотропинов на апоптоз фолликулов блокируется добавлением антагониста рецепторов ИЛ-1. Это доказывает роль эндогенного ИЛ-1b как медиатора апоптоза [7]. Миграция нейтрофилов внутри и вокруг преовуляторного фолликула регулируется гормонами благодаря локальной модуляции экспрессии ИЛ-8 [2].

Японскими учеными было изучено влияние гонадотропных гормонов на апоптоз и его регулирующие гены в лютеинизированных гранулезных клетках, полученных при аспирации фолликулов в программе ЭКО. Выявлено, что ФСГ ингибирует апоптоз не только в преантральном фолликуле, но и в лютеинизированных клетках во время ранней лютеиновой фазы. Уровень Fas, FasL, bax и p53 уменьшается при добавлении в культуру ткани ХГ. Fas, FasL, bax и p53 играют несомненную роль в индукции апоптоза гранулезных клеток, полученных после стимуляции в программе ЭКО [27].

Уровень sFas значимо выше в неполноценных овоцитах. Уровень sFas в фолликулярной жидкости не коррелирует со степенью фертильности, качеством эмбрионов. Растворимая форма Fas обнаружена в фолликулярной жидкости, стимулированных гонадотропинами яичниках, и может играть роль в предотвращении атрезии в фолликулогенезе, но не так важна для овоцитов, полученных в программе ЭКО. В этом случае апоптоз, возможно, регулируется системой

bcl-2 [15].

P. Moreira и соавт. [32] исследовали различия между уровнем апоптоза и содержанием гормонов в фолликулярной жидкости правого и левого яичников, стимулированных в программе ЭКО. Индекс апоптоза гранулезных клеток и уровень различных гормонов в фолликулярной жидкости не различались. Эти результаты показали, что при индукции овуляции гонадотропинами и аналогами гонадотропин-рилизинг-гормона в программе ЭКО нет превосходства в уровне апоптоза одного яичника над другим во время аспирации, в то время как количество овоцитов в яичниках различное, что, возможно, объясняет различную фертильность яичников в программе ЭКО.

С.S. Suh и соавт. [53] исследовали прогностическую значимость апоптоза гранулезных клеток, полученных у пациентов в программе ЭКО. Полученные после аспирации фолликула гранулезные клетки были обработаны антителами к bсl и иодидом пропидия. В группе беременных женщин индекс апоптоза был значительно ниже в сравнении с таковым у небеременных. Возраст пациенток, уровень ФСГ и эстрадиола в сыворотке крови, количество овоцитов, количество перенесенных эмбрионов и bcl-2-позитивность не имели различий в обеих группах. Обратная корреляция отмечалась между индексом апоптоза и уровнем ФСГ в крови. Индекс апоптоза в гранулезных клетках, равный 6,14% или ниже, прогнозирует наступление беременности (чувствительность метода 87,5% и специфичность 73,75%). Таким образом, анализ апоптоза гранулезных клеток может быть использован как прогностический индикатор успеха программы ЭКО.

R. Quintana и соавт. [44] изучали концентрацию сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) в гранулезной ткани и фолликулярной жидкости 30 пациенток с различной реакцией на контролируемую гиперстимуляцию яичников. Группа А (10) с 1-4 фолликулами, В (10) - с 5-14, С - более 15. Концентрация СЭФР в фолликулярной жидкости составляла 1232±209; 813±198 и 396±103 пг/мл для групп A, B, C в указанном порядке (p>0,01). Концентрация СЭФР в надосадочной жидкости составила 684±316; 1101±295 и 1596±227 пг/мл соответственно (p<0,05). Процент апоптоза гранулезных клеток был 55,02±7,5; 23,98±4,4 и 14,2±2,3 соответственно. Таким образом, у пациенток со сниженной реакцией яичников на контролируемую гиперстимуляцию концентрация СЭФР в фолликулярной жидкости повышена, концентрация СЭФР в надосадочной жидкости культуры гранулезных клеток понижена, а процент апоптоза гранулезных клеток повышен в отличие от этих показателей у пациенток с нормальной или повышенной реакцией. Концентрация ингибина В и эстрадиола повышается после стимуляции ФСГ и коррелирует с количеством овоцитов и размерами антральных фолликулов. Существует зависимость между ингибином В и овариальным резервом [65]. Исследование ингибинов А, В и эстрадиола в плазме крови у женщин в программе ЭКО показали, что существует зависимость между концентрацией ингибина А и эстрадиола в сыворотке крови и количеством фолликулов после стимуляции, а также зависимость наступления беременности от концентрации ингибина В [31]. Независимо от протокола стимуляции в программе ЭКО отмечается повышение концентрации как ингибина А, так и ингибина В в сыворотке крови [12].

Таким образом, апоптоз представляет собой процесс, неотъемлемый от функционирования яичника. Он отвечает за развитие доминантного фолликула и желтого тела, фолликулярную атрезию, овуляцию. Нарушения в процессе апоптоза ведут к развитию многих патологических состояний, включающих ановуляцию, СПКЯ, а также неопроцессы в яичнике. Задачей будущих исследований является изучение возможности медикаментозного влияния на апоптоз с целью коррекции патологических изменений в яичнике, а также возможности повышения положительных исходов программ ЭКО.

Литература

1. Amsterdam А. Dantes А. Hosokawa К. et al. Steroids 1998; 63: 314-318.

2. Bukulmez О. Arici А. Hum Reprod 2000; 6: 1: 1-15.

3. Chen Q. Yano T. Matsumi H. et al. Endocrinology 2005; 146: 2: 808-815.

4. Christopher B. Endocrinology 2000; 47: 4: 475-480.

5. Chudeska-Gaz A. Rzepka I. Kosmovska B. Gas C. Ginec Pol 1999; 70: 5: 236-241.

6. Chun S.-Y. Eisenhauer K.M. Kubo M. Hsueh A.J.W. Endocrinology 1995; 136: 3120-3127.

7. Chun S.-Y. Hsueh A.J.W. J Reprod Immunol 1998; 39: 63-75.

8. Czwain I. Amato P. Exp Cell Res 2000; 257: 1: 101-110.

9. Danilovich N.A. Bartke A. Winters T.A. Biol Reprod 2000; 62: 1: 103-107.

10. Depalo R. Nappi L. Loverro G. et al. Hum Reprod 2003; 18: 2678-2682.

11. Deveraux Q.L. Reed J.C. Genes 1999; 13: 239-252.

12. Fawzy M. Harrison R.F. Knight P.G. et al. Hum Reprod 2001; 16: 6: 1092-1097.

13. Hefler L. Mayerhofer K. Nardi A. et al. Obstet Gynec 2000; 96: 1: 65-69.

14. Johnson A.L. Biol Signals Recept 2000; 9: 2: 96-101.

15. Josе de los Santos M. Anderson D.J. Racowsky C. Hill J.A. Biol Reprod 2000; 63: 6: 1811-1816.

16. Khan S.M. Dauffenbach L.M. Yeh J. Biophys Res Commun 2000; 269: 2: 542-545.

17. Kondo H. Maruo T. Peng X. Mochizuki M. J Clin Endocrinol Metabol 1996; 81: 7: 2702-2710.

18. Kugu K. Ratts V.S. Piquette G.N. et al. Cell Death Differ 1998; 56: 1: 6: 67-76.

19. Kuranaga E. Kanuka H. Bannai M. et al. Biochem Biophys Res Commun 1999; 260: 1: 167-173.

20. Lail-Trecker M.R. Peluso C.E. Peluso J.J. Endocrinology 2000; 12: 3: 303-314.

21. Lee Y.S. Nakajima H. Chang Y.C. et al. Mol Cells 1998; 8: 3: 272-279.

22. Li A. Yang H. Wang F. et al. Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 1999; 30: 2: 158-161.

23. Li J. Kim J.M. Liston P. et al. Endocrinology 1998; 139: 1321-1328.

24. Makrigiannakis A. Amin K. Coukos G. et al. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 1: 449-459.

25. Marcinkiewicz J.L. Balchak S.K. Morrison L.J. Front Biosci 2002; 7: 1997-2005.

26. Marone M. Scambia G. Mozzetti S. et al. Clin Cancer Res 1998; 4: 2: 517-524.

27. Matsubara H. Ikuta K. Ozaki Y. et al. J Clin Endocrinol Metabol 2000; 85: 4: 1620-1626.

28. Matsumoto K. Nakayamа T. Sakai H. et al. Mol Reprod 1999; 54: 6: 103-111.

29. McGee E. Spears N. Minami S. et al. Endocrinol 1997; 13: 8: 2417-24.

30. Mikkelsen A.L. Hist E. Lindenberg S. Hum Reprod 2001; 122: 3: 481-486.

31. Millot F. Antoine J.M. Merviel P. et al. Gynec Obstet Fertil 2002; 30: 1: 36-41.

32. Moreira P. Saito H. Kaneko T. et al. Hum Reprod 1999; 14: 1: 156-161.

33. Morrison L.J. Marcinkiewicz J.L. Biol Reprod 2002; 66: 2: 450-457.

34. Murdoch W.J. J Endocrinol 1998; 156: 3: 503-508.

35. Murdoch W.J. Biol Signals Recept 2000; 9: 2: 102-114.

36. Murdoch W.J. Townsend R.S. McDonnel A.C. Biol Reprod 2001; 65: 5: 1417-1424.

37. Murdoch W.J. Van Kirk E.A. Mol Cell Endocrinol 2002; 186: 1: 61-67.

38. Norihiro Sugino, Takashi Susuki, Shiro Kashida et al. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 11: 4379-4386.

39. Okuda K. Korzekwa A. Shibaya M. et al. Biol Reprod 2004; 71: 6: 2065-2071.

40. Onalan G. Selam B. Baran Y. et al. Hum Reprod 2005; 20: 9: 2391-2395.

41. Palumbo A. Yeh Y. J Soc Gynec Invest 1995; 2: 3: 565-573.

42. Pastor L.M. Pallares J. Roca J. et al. Ital J Anat Embryol 2001; 106: 2: 257-262.

43. Peluso J.J. J Steroid Biochem 2003; 85: 167-173.

44. Quintana R. Kopcow L. Marconi G. et al. Hum Reprod 2001; 16: 9: 1814-1818.

45. Rodriguez G.C. Walmer D.K. Cline M. et al. J Soc Gynecol Investig 1998; 5: 5: 271-276.

46. Rodriguez G.C. Nagarsheth N.P. Lee K.L. et al. J Nat Cancer Inst 2002; 94: 1: 50-60.

47. Rohayem J. Conrad K. Zimmermann T. Frank K.-H. Clin Chem 1999; 45: 2014-2016.

48. Sakamaki K. Yoshida H. Nishimura Y. et al. Mol Reprod Dev 1997; 47: 11-18.

49. Savill J. Fadok V. Henson P. et al. Immunol Today 1993; 14: 131-136.

50. Sheau Yu Hsu, Hsueh, Aaron J.W. Physiol Rev 2000; 80: 2: 593.

51. Svanberg B. Ling C. Svensson P.A. et al. Mol Cell Endocrinol 2000; 164: 1-2: 183-190.

52. Svensson E.C. Markstrцm E. Andersson M. Billig H. Biol Reprod 2000; 63: 5: 1457-1464.

53. Suh С.S. Jee В.С. Choi Y.М. et al. J Assist Reprod Genet 2002; 19: 5: 209-214.

54. Tey B.T. Singh R.P. Piredda L. Piacentini M. Al-Rubeai M. Biotechnol Bioeng 2000; 68: 1: 31-43.

55. Tilly K.I. Banerjee S. Banerjee P.P. Tilly J.I. Endocrinology 1995; 136: 4: 1394-1402.

56. Thompson W.E. Branch A. Whittaker J.A. et al. Endocrinology 2001; 142: 9: 4076-4085.

57. Vickers S.L. Cowan R.G. Harman R.M. et al. Biol Reprod 2000; 62: 1: 54-61.

58. Vital Reyes V.S. Tillez Velasco S. Hinojosa Cruz J.C. Reyes Fuentes A. Gynec Obstet Mex 2001; 69: 101-107.

59. Wong J. Luckers L. Okawara Y. et al. Biol Reprod 2000; 63: 3: 756-762.

60. Wood A.W. Van Der Kraak G.J. Biol Reprod 2001; 64: 1: 264-271.

61. Wu J. Zhang L. Li T. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi 1998; 33: 3: 157-159.

62. Wu M.X. Daley J.F. Rasmussen R.A. et al. J Cell Biochem 1995; 198: 306.

63. Xu J.P. Li X. Mori E. et al. Zygote 1998; 6: 359-367.

64. Yang M.Y. Rajamahendran R. Biol Reprod 2000; 63: 5: 1313-1321.

65. Yong P.Y. Baird D.T. Thong K.J. et al. Hum Reprod 2003; 18: 1: 35-44.

66. Yu Y.S. Sui H.S. Han Z.B. et al. Cell Res 2004; 14: 4: 341-346.

67. Yu Y.S. Luo M.J. Han Z.B. еt al. Small Ruminant Research 2005; 57: 57-65.