Эндометриоз, генитальный эндометриоз, аденомиоз

Определение ароматазы цитохрома р450 в образцах эндометрия как диагностика эндометриоза

J.Kitawaki, I.Kusuki, H.Koshiba et al.

Fertility and sterility, vol.72,No.6, dec. 1996, p. 1100-1106.

Цель исследования: оценить клиническую значимость исследования уровня ароматазы цитохрома Р450 в биопсийных образцах эндометрия для диагностики эндометриоза.

Дизайн исследования: ретроспективное, случай-контроль.

Пациенты: у 105 женщин репродуктивного возраста с нормальным менструальным циклом проводили биопсию эндометрия при лапаротомии или лапароскопии. Гистологическое исследование выявляло эндометриоз, аденомиоз и/или лейомиому. Эндометрий пациенток с карциномой шейки матки in situ и отсутствием других гинекологических заболеваний считался здоровым.

Вмешательства: биопсия эндометрия

Исследования: определяли экспрессию ароматазы цитохрома Р450 методом ПЦР (с обратной транскрипцией) и иммуногистохимического анализа. Распределение и интенсивность окрашивания оценивали с помощью полуколичественного коэффициента Н.

Результаты: Присутствие ароматазы цитохрома Р450 обнаружено в образцах эндометрия женщин с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомой и не обнаружено в образцах здоровых женщин (коэффициент Н менее 20), чувствительность. 91%, специфичность 100%.

Заключение: экспрессия ароматазы цитохрома Р450 в образцах эндометрия здоровых женщин и женщин с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомы различается. Техника определения этого фермента может использоваться в клиниках по лечению бесплодия в качестве амбулаторной скрининговой поцедуры, выявляющей наличие эстроген-зависимой патологии.

Эндометриоз часто сочетается с хронической тазовой болью и бесплодием. Диангостические процедуры, такие как трансвагинальное УЗИ и МРТ, могут использоваться для скрининга эндометриоза, но для установления точного диагноза необходима лапароскопия или лапаротомия (1). Серологический анализ СА-125 используется для определения прогрессирования эндометриоза, но его применение для начальной диагностики ограничено (2). Необходим точный и простой диагностический тест на эндометриоз.

Эндометриоз встречается у женщин репродуктивного возраста и регрессирует в менопаузе или после овариэктомии, что позволяет предположить эстроген-зависимость этой патологии. Рецепторы к эстрогенам, андрогенам и прогестерону определены матодами гормон-лиганд. связывающего анализа (3) и иммуногистохимического анализа (4). Конверсия андрогенов в эстрогены происходит преимущественно в плаценте и яичнике и катализируется ароматазой, основным компонентом которой является ароматаза цитохрома Р450. Эстроген-зависимые заболевания матки, такие как карцинома эндометрия (5-7), эндометриоз (8,9), аденомиоз (10,11) и лейомиома (12,13) сочетаются с повышенной активностью ароматазы и экспрессией мРНК ароматазы цитохрома Р450. Это позволяет предположить, что ткани продуцируют эстрогены, которые могут отвечать за их патологический рост, взаимодействуя со своими рецепторами.

Предыдущие исследования нашей лаборатории (9) показали, что мРНК ароматазы цитохрома Р450 и сам фермент экспрессируются в эндометрии пациенток с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомой, и не экспрессируются в эндометрии менструирующих женщин с карциномой шейки матки in situ и отсутствием других гинекологических заболеваний. Эти находки показали, что хотя эндометрий пациенток с эндометриозом, аденомиозом и/или лейомиомой внешне похож на эндометрий здоровых женщин, метаболизм эстрогенов в эндометрии этих групп пациенток значительно различается. Эндометриоз, аденомиоз и лейомиома. это отдельные состояния, но у них сходная патофизиология, они развиваются у женщин репродуктивного возраста, их прогрессирование эстроген-зависимо. Аденомиоз и лейомиому сравнительно легко диагностировать с использованием визуализационной техники, а легкий или бессимптомный эндометриоз достаточно трудно идентифицировать.

Целью настоящего исследования было определить клиническую значимость исследования образцов эндометрия на содержание ароматазы цитохрома Р450 в качестве диагностического теста на эндометриоз.

Материалы и методы исследования

Образцы ткани

Образцы эндометрия брали с диагностической целью у 105 женщин, подвергшихся лапаротомии или лапароскопии. Информированное согласие было получено от каждой пациентки. Все пациентки были репродуктивного возраста (24-48 лет) и имели нормальные менструальные циклы. Пациентки не получали гормональную терапию (ни аналоги ГнРГ, ни даназол, ни КОК). Эндометриоз, аденомиоз и лейомиома были диагностированы при гистологическом исследовании удаленных маток (91 случай) или при исследовании биопсийных образцов (14 случай). Степень эндометриоза определялась по шкале Американского Общества Фертильности (1). Образцы эндометрия от пациенток с карциномой шейки матки in situ и отсутствием других гинекологических заболеваний расценивались как нормальные. Из исследования были исключены пациентки со следующими диагнозами: злокачественные новообразования (кроме карциномы шейки матки in situ), опухоли яичников, воспалительные процессы в малом тазу, беременность.

Свежие образцы разделяли на три части: одну часть немедленно замораживали при температуре ?80 градусов Цельсия и сохраняли для выделения общего количества РНК; две остальные части фиксировали в 4% параформальдегиде с добавлением буферного раствора 0,05М гидроксиметиламинометана гидрохлорида (рН 7,6) при 4С в течение 24 часов. Одну из этих порций подвергали гистологическому исследованию, а другую. иммуногистохимическому анализу. Образцы крови забирали до операции и определяли уровень сывороточного СА-125 иммунорадиометрическим методом с использованием специфических моноклональных антител м11 (Centocor, Malvern, PA).

Выделение РНК и ПЦР с обратной транскриптазой. Southern Blot Общее количество РНК выделяли, как было описано ранее (9), используя тризол (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Первичный синтез комплементарной ДНК (кДНК) катализировали с помощью Superscript II RT (GIBCO BRL), используя олиго(дезокситимидин)12-18, полученную кДНК использовали для ПЦР амплификации, как описано ранее (9). Использовали праймеры 5?-TTGTTGTTAAATATGATGCC-3? (прямой) и 5?-ATACCAGGTCCTGGCTACTG-3? (обратный) для человеческой ароматазы цитохрома Р450 и амплаймерный набор для определения человеческой глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (G3PDH) (Clontech, Palo Alto, CA). ПЦР-образец состоял из 1 мкл первичной кДНК, 1мкМ каждого праймера, 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозид 5?-трифосфатов (дНТФ), 2,5 Ед KOD Dash (Toyobo, Osaks, Japan), доведенных до общего объема 100 мкл ПЦР-буфером. Условия для ПЦР выдерживались следующие: 94С в течение 3 минут для денатурации гибрида РНК-кДНК; затем 40 циклов температурного режима 94С по 30 секунд, 45С (для ароматазы цитохрома Р450) или 55С (для G3PDH) - 2 секунды и 74С. 30 секунд. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану. Комплементарный образец 5?-TAATGATTGTGCTTCATTATGTG-3? для ароматазы цитохрома Р450 и образец для G3PDH (Clontech) были помечены на 5?-конце с помощью АТФ с фосфором 32P. Мембрану гибридизировали с меченым образцом в течение ночи при температуре 55С, и результаты исследовали на биоанализаторе (BAS 2000, Fujix, Tokyo, Japan).

Иммуногистохимический анализ

Образцы ткани фиксировали 4% раствором параформальдегида, заливали парафином и разрезали на пластины толщиной 4 мкм. Пластины отделяли от парафина и выдерживали в течение 5 мин в 3% растворе перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы, затем трижды отмывали с буферным раствором 0,05М гидроксиметиламинометана гидрохлорида (рН 7,6), содержащим 0,05% Tween 20 (буфер для отмывки) и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с Dako Protein Block Serum-Free (Dako, Carpinteria, CA) для блокировали связывания неспефицических белков. Пластины инкубировали в течение 24 часов при 4С с кроличьей антисывороткой к человеческой плацентарной ароматазе цитохрома Р450 (Pab R-8-2, 1:1,000), разведенной Dako Antibody Diluent (Dako). Характеристики специфической антисыворотки были описаны ранее (14).

Пластины отмывали трижды отмывочным буфером и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре Dako Envision. полимером с меченой пероксидазой, связывающимся с антикроличьими IgG (Dako). Далее пластины снова отмывали трижды отмывочным буфером, окрашивали раствором 3,3-диминобензидина гидрохлорида, а затем гематоксилином. Для положительного контроля присутствия ароматазы цитохрома Р450 использовали образцы человеческой плаценты. Для отрицательного контроля образцы инкубировали с неиммунизированной кроличьей сывороткой в том же разведении или Pab R-8-2, предварительно обработанной очищенной человеческой плацентарной ароматазой цитохрома Р450 (500 мкг ароматазы цитохрома Р450 на 1 мл разведенного Pab R-8-2) для блокирования активных участков связывания. Положительные и отрицательные контрольные образцы окрашивали точно так же и одновременно с каждой серией исследуемых образцов эндометрия. Интенсивность окраски анализировалась с помощью полуколичественного коэффициента H (15). Его рассчитывали по следующей формуле:

H = сумма(Pi), где i. интенсивность окраски 0, 1, 2 или 3 (отрицательная, слабая, умеренная, сильная, соответственно), а P. процент окрашенных клеток при каждом значении i (от 0 до 100%, соответственно). Приблизительно 500 железистых клеток изучались в каждом образце для высчитывания коэффициента Н, его среднее значение рассчитывалось как среднее арифметическое от двух значений, полученных двумя независимыми исследователями.

Статистический анализ

Различия коэффициента Н между группами определялись с помощью монофакторного вариационного анализа и множественных сравнений (процедура Sheffe). Персональные коэффициенты корреляции использовались для определения корреляции между сывороточным уровнем СА-125 и коэффициентом Н.

Результаты

Из 105 пациенток у женщин с эндометриозом (n=32) средний возраст пациенток составил 38,3+-7,9 лет, индекс массы тела. 21,2+-2,8 кг/м2; у женщин с аденомиозом - 42+-6,5 лет и 21,2+-3,1 кг/м2; у женщин с лейомиомой. 44,8+-4,5 лет и 21,6+-2,7 кг/м2; у женщин без гинекологических заболеваний (n=21). 37,2+-8,1 лет и 23,8+-4,6 кг/м2, соответственно. Средний возраст пациенток с лейомиомой был выше, чем пациенток с эндометриозом (р меньше 0,001) и здоровых женщин (р меньше 0,001). Различий индекса массы тела между группами не было.

Southern blot для определения экспресси мРНК ароматазы цитохрома Р450 осуществляли в каждом образце эндометрия, взятого для биопсии в течение менструального цикла. На рис.1 показано, что транскрипция ароматазы цитохрома Р450 определялась в образцах пациенток с эндометриозом, аденомиозом и лейомиомой, и не определялась в образцах нормально менструирующих женщин с отсутствием гинекологических заболеваний.

В попытке повысить чувствительность определения экспрессии ароматазы цитохрома Р450, в каждом биопсийном образце эндометрия был проведен иммуногистохимический полуколичественный анализ. Ароматаза цитохрома Р450 локализуется преимущественно в цитоплазме железистых клеток и очень слабо. в строме. Присутствие ароматазы цитохрома Р450 определялось в образцах эндометрия женщин с эндометриозом, взятых как в пролиферативную (рис. 2а), так и в секреторную фазы цикла (рис. 2в). Также определялась ароматаза цитохрома Р450 в обеих фазах цикла у женщин с аденомиозом и лейомиомой. В эндометрии нормально менструирующих женщин без гинекологических заболеваний ароматаза цитохрома Р450 не определялась ни в пролиферативную (рис. 2с), ни в секреторную фазу цикла (рис. 2d).

Интенсивность и распределение специфической окраски на ароматазу цитохрома Р450 оценивали полуколичественным методом с использованием коэффициента Н (Рис. 3). В образцах, полученных от пациенток с эндометриозом, аденомиозом, лейомиомой коэффициент Н широко варьировал. В 21 образце, полученном от женщин без гинекологических заболевний, коэффициент Н был менее 20, менее среднего значения в остальных группах (р меньше 0,0001). Разницы значений коэффициента Н в разные фазы цикла не было (рис. 3).

Оптимальное значение чувствительности (91%) и специфичности (100%) достигалось при пороговой величине коэффициента Н=20, положительная прогностическая ценность этой величины составила 100%, отрицательная прогностическая ценность. 72%. Положительное значение ароматазы цитохрома Р450 определялось в 80% образцов эндометрия от женщин с заболеваниями, независимо от того, было у женщины одно или несколько заболеваний. В группе с отсутствием гинекологических заболеваний значение Н было отрицательным (Табл. 1).

Табл. 1.

Определение ароматазы цитохрома Р450 в образцах эндометрия