Унифицированный метод определения гемолитической активности комплемента по 50 % гемолизу .

Комплемент, содержащийся в исследуемой сыворотке, вызывает гемолиз сенсибилизированных бараньих эритроцитов в присутствии сыворотки кролика, иммунизированного бараньими эритроцитами (гемолитическая сыворотка).

Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну 50 % гемолитическую единицу комплемента (CH50 ) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50 % 0,5 мл стандартной суспензии сенсибилизированных эритроцитов при 37 °С за 45 мин. Эта единица условная, величина ее зависит от концентрации бараньих эритроцитов, количества антител, использованных для сенсибилизации, величины рН, ионной силы системы. В связи с тем что присоединение к иммунному комплексу первого компонента комплемента не происходит в отсутствие Ca ++. а для присоединения 4-го компонента (следующего за активацией C1) необходимо наличие Mg ++. важно строго соблюдать концентрацию этих веществ в буферных растворах. Необходимо стандартизировать время реакции,температуру.

  1. Гемолитическая сыворотка (гемолизин). Выпускаются стандартные серии препарата в ампулах с титром гемолитической сыворотки, указанным на этикетке. Такие сыворотки имеют длительный срок годности при хранении при температуре 2—8 °С.
  2. Эритроциты барана.
  3. Веронал-мединаловый буфер.

pH 7,3—7,8 (5,75 г веронала растворяют в 500 мл горячен дистиллированной воды, смесь охлаждают до +20 °С, добавляют другие компоненты и доводят дистиллированной водой до объема 2 л. Буфер хранят при температуре 3—5°С)

Изначально гемолитическая активность комплемента определялась минимальным количеством сыворотки, вызывающим лизис 100 % определенного количества стандартных эритроцитов. Однако изучение литической активности комплемента в зависимости от его количества выявило сигмовидный характер кривой корреляции, причем полный гемолиз наступает в широкой зоне верхней части кривой, когда сенсибилизированные эритроциты малочувствительны к количественному возрастанию комплемента.

1. Приготовление буфера: в день постановки опыта к одной части буферного раствора добавить 4 части дистиллированной воды. Разведенный буферный раствор пригоден в течение 12 ч.

2. Обработка исследуемой сыворотки больного: кровь, взятую из вены больного в количестве 2—3 мл, оставляют на 2 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют 10—15 мин при 1500 об/мин. Сыворотку осторожно отсасывают и исследование проводят в тот же день.

Гемолитическая система — это смесь равных объемов разведенной по троекратному титру гемолитической сыворотки и 3 % взвеси бараньих эритроцитов от объема плотного осадка (100 мл 3 % взвеси и 100 мл разведенной гемолитической сыворотки: 0,1 мл гемолитической сыворотки и 99,9 мл изотонического раствора хлорида натрия). Приготовление 3 % взвеси бараньих эритроцитов: дефибринированную кровь барана отмывают 3 раза 5—10-кратными объемами изотонического раствора хлорида натрия, который после третьего отмывания должен быть бесцветным. Из плотного осадка эритроцитов готовят 3 % (по объему) взвесь в изотоническом растворе. Стандартизация взвеси эритроцитов барана: Густота взвеси эритроцитов барана оказывает значительное влияние на титр комплемента и поэтому имеет существенное значение. Наиболее точным методом стандартизации эритроцитов является фотометрирование. Используют для этой цели ФЭК М-56. Методика: За 15—20 мин до начала исследования включают ФЭК и устанавливают зеленый светофильтр; 1 мл 3 % взвеси отмытых бараньих эритроцитов добавляют в пробирку к 9 мл дистиллированной воды, полученную лизированную кровь вливают в 10-миллиметровую кювету, в другие две кюветы (такого же объема) наливают растворитель, т. е. смесь из 1 мл изотонического раствора и 9 мл дистиллированной воды.

В левый кюветдержатель ставят кювету с растворителем, в правый — кювету с лизированной кровью. Величину оптической плотности раствора отсчитывают по правой части барабана. Определенной концентрации эритроцитов соответствует определенный показатель шкалы оптической плотности. Если 3 % взвесь бараньих эритроцитов приготовлена правильно, то шкала оптической плотности показывает 0,4.

Если показатель оптической плотности менее 0,4, то к приготовленной взвеси следует добавить соответствующее графику количество эритроцитов. Если же показатель оптической плотности выше 0,4, то к приготовленной взвеси бараньих эритроцитов следует прибавить соответствующее количество изотонического раствора хлорида натрия (см. рис. ).

После приготовления 3 % взвеси эритроцитов готовят гемолитическую сыворотку. Разведение гемолитической сыворотки: Перед опытом ампулу вскрывают, содержащийся в ней лиофильный препарат разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия согласно инструкции. Гемолитическую сыворотку берут в разведении, которое в 3 раза превышает ее исходную концентрацию. Так, если титр гемолитической сыворотки равен 1:1200, готовят разведение 1:400. Исходя из необходимого для постановки реакции объема гемолитической системы, отмеривают нужное количество гемолитической сыворотки. После этого ампулу запаивают и остаток гемолитической сыворотки сохраняют до следующего опыта в холодильнике при 4—8 °С. Только после приготовления 3 % взвеси бараньих эритроцитов и разведения по титру гемолитической сыворотки можно приступить к приготовлению гемолитической системы.

Смешивание гемолитической сыворотки (0,1 мл и 99,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) с эритроцитами производят по возможности быстро, причем гемолитическую сыворотку примешивают к взвеси эритроцитов, а не наоборот. Смесь выдерживают при 37 °С в термостате 30 мин для сенсибилизации эритроцитов.

Исследуемую сыворотку, разведенную 1:10 буферным .раствором, разливают в 2 пробирки: 0,1 и 0,25 мл. Разлитую сыворотку (1:10) доводят веронал-мединаловым буфером до объема 1,5 мл. Затем в каждую пробирку прибавляют 1,5 мл стандартизированной гемолитической системы. Одновременно с опытными пробирками ставят контроль на отсутствие гемолиза сенсибилизированных эритроцитов: 1,5 мл гемолитической системы и 1,5 мл веронал-мединалового буфера. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 45 мин. После инкубации их охлаждают в рефрижераторе при 2—4 °С в течение 18—19 ч. На следующий день проводят фотометрирование надосадочной жидкости из каждой пробирки (против изотонического раствора хлорида натрия или дистиллированной воды в контрольной кювете колориметра).

Для учета степени гемолиза необходимо использовать шкалу стандартных разведении лизированных эритроцитов по А. П. Конникову, которую готовят для каждой партии эритроцитов и гемолитической сыворотки, как указано: