Количественная обработка результатов ПЦР

Как уже было отмечено, метод ПЦР отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, однако количественная оценка продуктов амплификации с помощью обычного ПЦР и его вариантов, особенно, если необходимо измерить исходное содержание ДНК-матрицы в анализируемом образце, является достаточно сложной задачей. Выход продукта, образующегося в процессе полимеразной реакции, зависит не только от количества введенной в пробу ДНК, но и от состава образца. Кроме того, после определенного цикла амплификации накопление ее продукта постепенно замедляется. Таким образом, при детекции продуктов ПЦР после амплификации практически невозможно учесть все факторы, оказывающие влияние на ход реакции и с точностью оценить количество ДНК-мишени.

Простым и распространенным, но не слишком надежным способом полуколичественного ПЦР-анализа, является использование внутреннего стандарта, который анализируют одновременно с образцом определяемой ДНК. Внутренними стандартами служат фрагмент ДНК (так называемая конкурентная ДНК-competitor DNA), который, как и фрагмент определяемой ДНК содержит участки отжига праймеров, но при одновременной амплификации дает продукт иного размера, чем целевой ампликон, или фрагменты «генов домашнего хозяйства», для которых используют специфичные к ним праймеры. После проведения несколько реакций с различными разведениями внутреннего стандарта, результаты оценивают с помощью электрофореза или гибридизации с ДНК-зондами.

Для более точной количественной оценки разработан подход, позволяющий отслеживать кинетику накопления продуктов амплификации и измерять их количество во время реакции. Этот подход лежит в основе метода ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)

Данный метод дает возможность регистрировать продукты ПЦР непосредственно в ходе реакции и получать калибровочные графики для процесса амплификации, происходящего в каждой отдельной пробирке во время каждого цикла на протяжении всего времени проведения анализа. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РТ) — более быстрый и чувствительный метод диагностики фитопатогенов, по сравнению с классическим ПЦР. Он дает информацию не только о присутствии, но и о количестве патогена в исследуемом образце непосредственно после этапа амплификации и не требует отнимающей дополнительное время стадии электрофоретического разделения продуктов. Специфичность ПЦР-РТ анализа иногда оказывается выше, чем у альтернативных вариантов ПЦР, что позволяет различать последовательности, отличающиеся по одной паре оснований, например, для того, чтобы выявлять устойчивые к фунгицидам штаммы и отличать их от восприимчивых. Разработаны методики ПЦР-РТ, при которых вся процедура проходит в закрытой системе, что предотвращает контаминацию и получение и ложно-положительных результатов.

Для ПЦР-РТ используют флуоресцентные зонды и специальное оборудование. Амплификацию проводят в приборе, снабженном устройством для освещения пробирок светом с длиной волны, возбуждающим флуоресценцию, и многоканальным флуоресцентным детектором, позволяющим измерять уровень флуоресценции в каждой пробирке. Флуоресцентный зонд может быть либо включен в амплифицируемый фрагмент, либо, напротив, освобождаться в реакционную смесь в процессе амплификации. Если необходимо анализировать несколько разных ДНК-мишеней, можно использовать зонды, связанные с различными флуоресцентными красителями.

Существует несколько способов детекции продукта ПЦР-РТ. При наиболее простом из них применяют интеркалирующий флуоресцентный краситель, в частности SYBRgreen (рис. 3.3-1). Однако, этот способ имеет существенный недостаток: краситель будет в равной степени окрашивать как специфический (определяемый), так и неспецифический ампликон, если последний будет образовываться в результате реакции.

Другой, пожалуй наиболее распространенный способ, основан на применении флуоресцентного зонда типа TaqMan (рис. 3.4). TaqMan-зонды представляет собой последовательность из 25-30 олигонуклеотидов, меченных с 5-конца флуорофором (обычно производным флуоресцеина, например, 6-карбоксифлуоресцеином / 6-FAM), а с 3'-конца — гасителем флуоресценции (чаще всего родаминовым красителем TAMRA). Taq-полимераза, которая достраивает новую цепь ДНК, обладает 5-3'эндонуклеазной активностью в отношении двуцепочечных фрагментов ДНК, которые она устраняет, отщепляя один или несколько нуклеотидов. Поскольку наряду с флуорофором к олигонуклеотидному зонду присоединен гаситель, в начале амплификации наблюдается лишь незначительная эмиссия. По мере того, как фермент наращивает цепь, он расщепляет зонд. Флуорофор освобождается от соседства с гасителем и переходит в раствор. В результате чего флуоресценция усиливается и может быть измерена. Уровень флуоресценции, и соответственно, измеряемый сигнал, возрастает пропорционально количеству образующегося ампликона.

При создании зондов, построенных по типу молекулярных биконов и Scorpion™, также используют принцип пространственного разделения флуорофора и гасителя (рис. 3.3-2). Эти зонды сконструированы таким образом, что образуют структуру, напоминающую шпильку, в которой гаситель и флуорофор крепятся к концевым нуклеотидам «шпильки». Когда гаситель и хромофор расположены в непосредственной близости, флуоресценция зонда поглащается гасителем. Во время отжига происходит гибридизация зонда с целевым фрагментом ДНК, после чего за счет пространственного разделения флуорофора и гасителя, регистрируется флуоресценция.

Другой, относительно более новый, тип зонда — FRET-зонд, использующий перенос энергии резонанса флуоресценции (рис. 3.3-3). В этом случае детекция осуществляется с помощью двух разных зондов, помеченных двумя разными флуорохромами, один из которых способен передавать свою энергию возбуждения другому, когда флуорохромы находятся на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. Сближение двух флорохромов приводит к гашению флуоресценции первого и возбуждению флуоресценции второго. Флуоресциенция излучающего флуорохрома возрастает пропорционально количеству вновь синтезированной ДНК, что позволяет прослеживать процесс амплификации ДНК-мишени. FRET довольно редко применяется для диагностики фитопатогенов, пока его применение ограничено случаями, когда требуется очень высокий уровень специфичности определения.

В последние годы, ПЦР в реальном времени широко применяют для практических целей в фитопатологии. Ряд книг и обзоров полностью или частично посвящен данному методу и его применению для детекции и идентификации фитопатогенов. Он используется при диагностике болезней растений в полевых условиях, в том числе тех, возбудителями которых, являются наиболее вредоносные и карантинные патогены, особенно когда необходима быстрая и точная их идентификация. Например, вируса пятнистого увядания томата, потивируса сливы, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Phytophthora infestans, P. citricola, Septoria tritici, Puccinia recondita, Р. striiformis, Tilletia indica, Phomopsis longicola, Rhizoctonia solani. Разработаны протоколы ПЦР в реальном времени для анализа генов, участвующих в токсигенезе у продуцирующих трихотеценовые микотоксины грибов рода Fusarium и образующих афлатоксины видов Aspergillus.

ПЦР в реальном времени относительно прост в исполнении и не требует больших временных затрат. Процесс анализа полностью автоматизирован, что позволяет проверять большое количество образцов в одном эксперименте. На сегодняшний день для проведения ПЦР в реальном времени доступен целый ряд приборов, в том числе и портативных.

Наряду с преимуществами относительно классического ПЦР-анализа у метода ПЦР в реальном времени есть общие с ним ограничения. Например, оба вида ПЦР определяют не только живые, но и мертвые клетки или свободную ДНК, что иногда может привести к ошибкам при выяснении причин возникновения болезни.

ПЦР в формате FLASH

Как ПЦР в реальном времени, вариант FLASH (Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization) дает возможность регистрировать флуоресцентное свечение реакционной смеси непосредственно после реакции, не открывая пробирки. При этом измерения проводят с помощью детектора флуоресценции по «конечной точке» реакции (end-point detection). Отсутствие стадии разделения продуктов электрофорезом предотвращает загрязнение анализируемого образца посторонними ампликонами и сокращает время постановки диагноза до 2-3 часов (рис. 3.5).

БИО-ПЦР (BIO-PCR)

Для обнаружения жизнеспособных патогенов, в частности фитопатогенных бактерий, разработан метод БИО-ПЦР, при котором перед ПЦР или ПЦР в реальном времени их культивирование проводят на селективных средах. Анализируемый образец помещают на агаризованную или в жидкую среду и инкубируют, чтобы определяемые бактерии накопились в количестве, достаточном для диагностики. Затем их смывают с поверхности агара или осаждают из жидкой среды центрифугированием и отбирают от 1 до 10 микролитров образца для ПЦР. Этот метод отличается высокой чувствительностью и особенно подходит для быстро растущих видов, образующих точечные колонии за 15-48 часов. Одна колония такого размера за указанное время обычно производит не менее 1000 клеток/мл, что оказывается минимально достаточным для анализа. Чувствительность БИО-ПЦР может быть увеличена, если предварительно профильтровать образец через мембрану, способную абсорбировать бактериальные клетки. Эту мембрану накладывают лицевой стороной на поверхность агара и инкубируют до момента появления колоний. От одной до нескольких бактериальных клеток, сорбированных на мембране достаточно для того, чтобы их число в процессе культивирования возросло в тысячи раз, и они могли бы быть проанализированы с помощью ПЦР.

Изотермальная петлевая амплификация (Loop-mediated isothermal amplification — LAMP)

Предложенный в 2000 г. метод изотермальной петлевой амплификации открыл новые возможности в области эффективной и относительно малозатратной диагностики фитопатогенов, которая к тому же может быть осуществлена в лабораториях, не имеющих сложного оборудования, или в поле.

По сравнению с классическим вариантом ПЦР, LAMP является более быстрым и простым методом. Она позволяет амплифицировать целевые последовательности ДНК в изотермальных условиях. В этом случае нет необходимости применять термоциклеры, а достаточно располагать водяной баней или нагревательным блоком, обеспечивающими температуру 60-65 °C. Одной из особенностей данного метода является участие от четырех до шести праймеров (прямых и обратных внутренних, а также прямых и обратных внешних), которые распознают, соответственно, от шести до восьми различных комплементарных участков на анализируемой ДНК. Это придает диагностике на основе LAMP исключительно высокую специфичность.

При температуре в районе 65 °C двуцепочечная ДНК находится в состоянии динамического равновесия, что делает возможным отжиг одного из внутренних праймеров на комплементарной последовательности ее цепи. Это инициирует синтез ДНК, в котором участвует фермент Bst полимераза (из Bacillus stearothermophilus ), обладающая специфической активностью, вызывающей смещение цепи ДНК. Под действием этого фермента происходит освобождение одноцепочечной ДНК, которая служит матрицей на последующих этапах амплификации. После нескольких циклов конечные продукты LAMP представляют собой фрагменты ДНК, которые имеют несколько инвертированных повторов целевого фрагмента и несут многочисленные петли, образующие структуры, напоминающие соцветие цветной капусты. Поскольку в результате LAMP ДНК образуется в больших количествах, амплифицированные продукты легко обнаружить просто невооруженным глазом без их предварительного электрофореза.

Разработаны варианты метода изотермальной петлевой амплификации с привлечением обратной транскрипции (RT-LAMP) и проведением в реальном времени (real time LAMP).

В настоящее время LAMP уже успешно используется для диагностики ряда фитопатогенов, например, для быстрой одностадийной идентификации Y-вируса картофеля, а также бактерии Ralstonia solanacearum, поражающей более 200 видов растений.

Метод микроэррэй-анализа (Microarray)

Одной из стоящих на повестке дня задач современной фитопатологии является обнаружение одного или сразу нескольких фитопатогенов среди других патогенных и непатогенных микроорганизмов в микробных сообществах и биологических матрицах.

Интересное решение этой задачи дает использование так называемой «обратной гибридизации», при которой применяют следующую методику. Набор из контрольных последовательностей ДНК фитопатогенов, которые подлежат определению, фиксируют на подходящем носителе, а в качестве комплексного зонда выступает тотальная ДНК, выделенная из образца (растительной ткани, почвы и проч.), в которую вводят флуоресцентную метку. Обычно предварительно ДНК амплифицируют посредством ПЦР. Гибридизация с контрольными ДНК приводит к определенной картине распределения положительных сигналов, которая показывает, что искомый организм содержится в анализируемом образце. Таким образом, в одном эксперименте может быть выявлено и идентифицировано несколько микроорганизмов.

В настоящее время в области диагностики фитопатогенов этот подход развивается в сторону увеличения числа одновременно определяемых возбудителей. В перспективе их число может быть доведено до сотен и тысяч. Такая высокоемкая диагностика имеет вполне реальное будущее, благодаря появлению технологии создания биочипов, или ДНК-чипов (в англоязычной литературе эту технологию принято называть microarray или gene array).

Микроэррэй-анализ, одно из последних достижений молекулярной биологии, является мощным инструментом функциональной геномики. Впервые он был применен в 1995 г. для одновременного анализа экспрессии большого числа генов. Используя технологию биочипирования, в одном эксперименте сейчас анализируют сотни (macroarray) и тысячи (microarray) генов одновременно. Этот метод обладает гигантским потенциалом в отношении обнаружения, идентификации и генотипирования патогенов, в том числе, поражающих растения. Для практической диагностической фитопатологии появление микроэррэй-анализа имеет важное значение, поскольку в природе растение обычно инфицировано несколькими патогенами, которые к тому же могут действовать совместно, вызывая комплексное заболевание.

При создании матрицы используют роботы, которые наносят специфичные последовательности ДНК патогенов (ПЦР продукты, клонированные гены и т. п.) в ячейки на специальную подложку (обычно из нейлона или стекла). Готовая матрица (чип) содержит множество ячеек «заряженных» нуклеотидными последовательностями, специфичными для множества различных патогенов. ДНК анализируемого образца амплифицируют с помощью ПЦР, метят флуоресцирующими красителями и гибридизуют с матрицей. Если последовательность в какие-либо из ячеек биочипа оказывается комплементарной определяемой ДНК, последняя связывается с ней, и после облучении светом определенной длины волны в этих ячейках появляется свечение. По характеру и интенсивности флуоресцентного свечения с помощью специального сканера-анализатора определяют количество характерных последовательностей ДНК. Этим способом было, например, обнаружено несколько видов бактерий, а также оомицетов — представителей родов Phytophlhora и Pythium среди других микроорганизмов в образцах почвы. Кроме того, созданы биочипы для вирусов, в частности нескольких вирусов картофеля и вируса мозаики огурца, вироида веретеновидности клубней картофеля и фитобактерий родов Xanthomonas и Xylella. В качестве гибридизационных зондов при микроэррэй-анализе часто используют зонды типа PLP (Padlock probe) — длинные нуклеотидные последовательности, 5'- и 3'-концы которых комплементарны целевым последовательностям патогена, и которые в молекулах ДНК или РНК распознают близко расположенные участки. Такие зонды разработаны, например, для четырех видов Phytophthora, Pythium ultimum, Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae и Rhizoctonia solani. Одним из перспективных направлений применения микроэррэй-анализа в настоящее время является обнаружение карантинных объектов при необходимости контроля больших партий подлежащих проверке образцов.

Для обнаружения и идентификации фитопатогенов используют также другой тип матрицы, называемый наночипом, в котором электродная матрица обеспечивает непосредственный контроль транспорта электрически заряженных молекул в микрозоны связывания их с иммобилизованными биотинилированными олигонуклеотидными зондами или продуктами ПЦР. Регулируя напряженность электрического поля, можно создать более строгие условия для гомологичной гибридизации и тем самым повысить специфичность диагностики. Оказалось, что наночипы позволяют выявлять у патогенов различия на уровне одного нуклеотида. Они были использованы для идентификации вирусов картофеля (Y, X и вирус скручивания листьев), а также фитопатогенных бактерий (Ralstonia solanacearum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, P. carotovorum subsp. atrosepticum, P. chrysanthemi и Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus).

RAPD-ПЦР

Как можно видеть, современная фитопатология располагает целым рядом основанных на ПЦР возможностей диагностики патогенов. При этом доступность информации, полученной в результате секвенирования генома фитопатогенов, является существенным условием, поскольку исследователю полезно иметь представление о последовательности ДНК, которую предполагают использовать для детекции и идентификации возбудителя болезни. Так как специфичность ПЦР обусловлена праймерами, важным требованием для успеха ПЦР-анализа любого типа является их подбор.

Поскольку относительно небольшие геномы вирусов и вироидов расшифрованы, и в соответствующих базах данных доступна полная информация об их последовательностях, подбор праймеров для анализа их ДНК или РНК не представляет большой проблемы. Меньше информации собрано о геномах бактерий, оомицетов и грибов, хотя объем данных постоянно и быстро растет. ПЦР-диагностика этих патогенов может осуществляться как на основе анализа известных последовательностей целевого фрагмента ДНК, так и на амплификации ее случайно выбранного региона.

В качестве целевой последовательности для бактерий, оомицетов и грибов обычно используют ДНК, кодирующую рибосомальную РНК (рДНК). Несколько фактов делают рДНК подходящей для целей диагностики. Во-первых, в клетке присутствует много копий рДНК, что увеличивает чувствительность детекции. Во-вторых, гены рДНК присутствуют во всех организмах и содержат высоко консервативный 5.8S-peгион, который делает возможность детекции на основе рДНК универсальной. В то же время, данная последовательность содержит высоко вариабельные регионы, такие как внутренние транскрибируемые сайты (ITS). Консервативные регионы могут быть использованы для подбора универсальных праймеров при детекции группы микроорганизмов внутри крупного таксона (для всех оомицетов, грибов или бактерий), в то время как наличие вариабельных регионов позволяет выявить разные расы, штаммы и изоляты. Другие последовательности, используемые для детекции грибов — это гены «домашнего хозяйства», например, гены бета-тубулина или гены, связанные с устойчивостью к фунгицидам. У бактерий источником целевых фрагментов обычно служат плазмидная ДНК и гены, связанные с патогенностью.

Если целевая последовательность не известна, подходящим методом является ПЦР с произвольной амплификацией полиморфной ДНК (Random Amplification of Polymorphic DNA — RAPD) или ПЦР с вырожденными праймерами. Другое название RAPD-ПЦР — ПЦР с произвольными праймерами (Arbitrary Primed PCR — AP-PCR). Метод RAPD-ПЦР, особенно в сочетании с анализом полиморфизма по длине фрагментов рестрикции (restriction fragment length polymorphism — RFLP) нашел широкое применение при исследованиях полиморфизма ДНК, картировании генов, а также в популяционной генетике и эволюционной биологии. В диагностике фитопатогенов, RAPD-ПЦР используют, когда необходимо обнаружить последовательности, специфичные для близкородственных видов, штаммов, рас и изолятов, чтобы различить их. Данный метод требует проведения тщательной очистки анализируемой ДНК.

В противоположность выше упомянутым видам ПЦР-анализа, где используются два праймера, ограничивающие последовательность ампликона, при RAPD-ПЦР происходит отжиг одного праймера небольшого размера, который комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых патогенов. Праймер связывается с комплементарными последовательностями геномной ДНК, и после амплификации, образуются продукты произвольной длины, которые ограничены на обоих концах случайно отожженной последовательностью частично или полностью гомологичной праймеру. Полиморфизм ДНК, вызванный вставками, делециями или заменами оснований, приводит к тому, что у разных организмов образуются как одинаковые, так и разные продукты RAPD-ПЦР, что выражается в наличии или отсутствии совпадающих или несовпадающих полос в геле после электрофореза. Подбирая условия реакции, удается добиться отличающихся картин ПЦР для последовательностей из близкородственных фитопатогенов, когда часть полос будет специфична только для конкретного организма. Чтобы получить картину разделения, характерную для целевого организма, необходимо протестировать много разных праймеров. Последовательности из выявленных специфичных полос могут быть использованы для синтеза высокоспецифичных праймеров.

Завершая описание методов, основанных на анализе нуклеиновых кислот, следует отметить, что ПЦР не единственный способ диагностики фитопатогенов с привлечением амплификации. Так, некоторые патогены растений были идентифицированы с помощью лигазной цепной реакции (ЛЦР Ligase Chain Reaction — LCR), которую катализирует ДНК-зависимая ДНК-лигаза. Данный фермент способен сшивать цепь ДНК в присутствии аденозин трифосфата (АТФ) и ионов Mg2+, по месту разрыва фосфодиэфирной связи. ЛЦР позволяет выявлять точечные мутации возбудителей заболеваний. Применимость ЛЦР в диагностике фитопатогенов может быть проиллюстрирована примерами ее использования для детекции вирусов картофеля А и Y в клубнях, идентификации Erwinia stewartii, а также дифференциации оомицетов Phytophthora infestans, Р. mirabilis и Р. phaseoli от других видов рода Phytophthora. В последнем случае LCR была применена совместно с ELISA.