2. ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздравсоцразвития России

Резюме | Комментарии | PDF (129 K) | Дата публикации: 02.07.2012

В России проблема скрининга, ранней диагностики рака толстой кишки и своевременной дифференциальной диагностики с воспалительными заболеваниями кишки до сих пор остает­ся нерешенной. Это связано не столько с отсутствием должного государственно­го финансирования, сколько с недостаточной разработкой критериев, с помощью которых можно выделить группу лиц, подлежащих углубленному клинико-инструментальному обследованию [1]. До настоящего времени эффективность скрининговых программ по выявлению колоректального рака в России не превышает 1 % [1]. Несмотря на это, целесообразность использования диагнос­тических методов, направленных на раннее выявление рака толстой кишки, уже научно обоснована на примере многих западных стран, таких как США, Япония, Австралия, Германия. Считается, что в 90 % случаев рак толстой кишки можно пре­дупредить [9]. Основанием для таких убеждений служат знания о патогенезе опухо­лей в толстой кишке. Высокую вероятность развития колоректального рака (КРР) имеют пациенты, страдающие воспалительными заболеваниями толстой кишки (прежде всего, неспецифический язвенный колит), с семейной предрасположенностью к данной форме рака и/или имеющие полипы толстой кишки. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) повышают риск развития рака толстой кишки, особенно если неспецифический язвенный колит длится более 10 лет. Недавние исследования показали, что болезнь Крона на 5-10 % повышает риск раковых заболеваний [3]. Частота случаев развития рака из ворсинчатых аденом (полипов) более 2 см в диаметре составляет 35-53 %. При полипах диаметром более 3 см вероятность их озлокачествления составляет 100 % [3].

Используемые в настоящее время методы диагностики рака толстой кишки малоэффективны для обнаружения опухоли до ее клинической манифестации. Белковые онкомаркеры, детектируемые в сыворотке/плазме крови при помощи иммуноферментного анализа, несмотря на относительно высокую специфичность (до 97 %), не обладают достаточной чувствительностью - не более 60 % [4], что ограничивает их использование для ранней диагностики рака толстой кишки. Большую распространенность при скрининге рака толстой кишки получили биохимические и иммуногистохимические тесты, идея которых основывается на обнаружении скрытой крови в фекалиях пациента [5]. Однако этот подход не удовлетворяет потребностей клинической онкологии из-за низкой чувствительности и специфичности. Действительно, далеко не все злокачественные новообразования толстой кишки характеризуются кровотечением. С другой стороны, скрытое кровотечение может сопровождать ВЗК [5], что сразу ставит актуальную задачу дифференциальной диагностики воспалительных и онкологических заболеваний кишки.

Таким образом, поиск новых маркеров, пригодных для ранней диагностики рака толстой кишки, которые бы позволяли выявить заболевание с высокой чувствительностью, а также специфичностью, позволяющей дифференцировать опухоли от ВЗК, является актуальной задачей. В качестве таких маркеров наиболее перспективным представляется использование патогенетически значимых молекулярно-генетических маркеров, которые могут быть обнаружены в циркулирующей крови. Действительно, ДНК трансформированных (опухолевых) клеток обнаруживаются во внеклеточных ДНК, циркулирующих в плазме крови (цир. ДНК) [2], и могут быть использованы для малоинвазивной диагностики опухолей. Одним из таких методов для ранней диагностики рака толстой кишки является определение в крови метилированной ДНК гена SEPT9, кодирующего синтез гена-супрессорасептина-9 [6].

Целью работы явилось провести сравнительный анализ эффективности дифференциальной диагностики воспалительных и онкологических заболеваний у больных с положительным результатом теста на скрытую кровь в кале с помощью определения эпигенетических маркеров (метилированная форма ДНК гена SEPT9) в составе циркулирующей ДНК крови и пептидных копрологических маркеров.

Материалы и методы. Исследования были проведены на базе ГБУ Ростовской области «Областной консультативно-диагностический центр» с 2008 по 2011 г. На первом этапе больным проводили анализ кала на скрытую кровь (СКК) с помощью фотометрического анализатора Sentifob и теста FOB Gold. Тест FOB Gold позволял точно определить количественное содержание гемоглобина в кале без предварительного придерживания пациентами диеты. Метод основан на реакции агглютинации антиген-антитело между присутствующим в образце гемоглобином человека и анти-гемоглобин-антитело на латексных частицах. Агглютинация измерялась как увеличение при абсорбции в 570 нм, единица которой пропорциональна количеству гемоглобина человека в образце.

Далее у 71 пациента (42 мужчин и 29 женщин) в возрасте 38-72 лет с положительным результатом анализа кала на СКК определяли уровень фекального кальпротектина и проводили тест на детекцию метилированной ДНК гена SEPT9 среди цир. ДНК.

Количественное определение содержания кальпротектина в образцах стула проводили иммуноферментным анализом (ELISA) с помощью стандартных наборов Buhlmann (Швейцария).

Наличие метилированной ДНК гена SEPT9 определяли в крови с помощью ПЦР. Для проведения методики использовали EpiproColontest (Epigenomics, Германия). Образцы ДНК модифицировали путем бисульфитной конверсии по стандартному протоколу по DevosT. etal .[6] , очищали с помощью наборов для выделения модифицированной ДНК «BisulfitessDNAIsolationKit» фирмы «BioSilicaLtd.». В образцах плазмы одновременно определяли ДНК SEPT9 ибета-актина (ACTB). Вывод об обнаружении гена SEPT9 делали, если количество циклов при анализе ДНК SEPT9 было менее 45, а АСТВ - менее 36. Вывод об отрицательном результате делали при отсутствии специфичного участка ДНК либо при превышении количества циклов для SEPT9 более 45, а для АСТВ - более 36 циклов.

В качестве контрольной была сформирована выборка из 25 практически здоровых пациентов (возрастной интервал - 40-60 лет. 4 мужчин и 11 женщин), безонкологических и воспалительных заболеваний кишки в анамнезе.

На окончательном этапе пациентам проводили колоноскопию. В результате проведения колоноскопии забирали биоптаты кишки для последующего гистологического анализа. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, проводили световую микроскопию.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы STATISTICA 7.0 (StatSoft, США).

Результаты и их обсуждение

Результаты определения уровня фекального кальпротектина у 71 больных с положительным результатом теста на СКК и 25 здоровых пациентов отражены в табл.1.

Таблица 1 Результаты определения уровня фекального кальпротектина у больных с положительным результатом теста на СКК и у здоровых пациентов